脂質納米顆粒(LNPs)作為核酸遞送的多功能納米載體，在醫學領域發揮著重要作用，包括癌癥免疫療法、代謝調節和預防性疫苗等方面。典型的LNPs配方由可電離的陽離子脂質、輔助脂質、膽固醇和聚乙二醇(PEG)四種脂質組成，這些成分在穩定性、結構、包封效率以及體內外相互作用中都發揮著至關重要的作用。負載了核酸的LNPs的內部結構和表面形態會隨著脂質成分的不同而產生變化，從而影響終產品的穩定性和治療效果。

為了提高核酸遞送的效率，研究者已經開發了多種先進技術對裝載核酸的LNPs進行結構表征，其中小角中子散射(small angle neutron scattering, SANS)通過氫和氘的中子散射長度密度差異可以揭示mRNA-LNPs中的脂質分布。然而，以往的SANS分析往往基于一個理想化的假設——即LNPs內的mRNA是均勻分布的，卻忽視了可能存在空載LNPs的情況。此外，最近有研究表明，通過商業微流控技術制備的mRNA-LNPs樣品中可能混有空載的LNPs。這一發現對SANS的結構數據可靠性提出了挑戰，并提示我們需要對SANS的結構模型進行重新評估。

近日，來自上海交通大學的團隊在bioRxiv平臺發布了一篇題為“Structural Characterization of mRNA Lipid Nanoparticles in the Presence of Intrinsic Drug-free Lipid Nanoparticles”的文章，通過結合SANS和納米流式檢測技術(NanoFCM)，開發了一種在空載LNPs存在的情況下表征mRNA-LNPs結構的方法，這對于mRNA-LNPs的機制研究和質量評估具有重要意義。

一、空載LNP和mRNA-LNP樣品的基本表征
研究人員采用Moderna開發的COVID-19 mRNA疫苗的脂質配方，通過包裹長度為2856 nt的mRNA制備mRNA-LNPs，并用相同的配方制備了空載的LNPs作為對照。粒徑分析結果顯示，mRNA-LNPs的粒徑相較于空載LNPs有所增大(圖1a)。此外，冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)結果顯示，空載LNP和mRNA-LNP樣品均呈現出皰疹樣形態，即近似球形但不規則的結構，且具有明顯的電子密度分區(圖1b)。為深入研究mRNA-LNPs的內部結構，作者進一步使用小角度X射線散射(small angle X-ray scattering, SAXS)表征兩種樣品。SAXS曲線顯示，mRNA-LNPs相較于空載LNPs在q~0.13 Å-1處多了一個峰(圖1c)，這個結果與早前的研究吻合，即mRNA分子嵌入脂質復合物后會在q~0.1 Å-1處產生一個特征峰。另外，SAXS數據沒有發現mRNA水溶液的特征峰，證明本研究的mRNA-LNPs中存在脂質-mRNA混合物。結合以上結果，作者提出了mRNA-LNPs由水相和含有mRNA的脂質相組成的模型，這個結構模型與其它研究不同，大多數研究者認為皰疹狀形態是由包含mRNA的水相和脂質相構成的。最后，作者評估了兩種樣品的包封率和體外轉染效力(圖1d、1e)，進一步證實了該LNP配方的高質量和有效性。
 

圖1. 空載LNP和mRNA-LNP樣品的基本表征

二、空載LNPs的結構表征
LNPs在mRNA疫苗中具有雙重作用，既可作為增強免疫效果的佐劑，又可能成為免疫原引發不良反應。因此，在空載LNPs顯著存在的情況下，了解LNPs的結構對于闡明mRNA疫苗的藥代動力學和生物分布至關重要。作者采用超小角中子散射(very small angle neutron scattering, VSANS)技術來表征空載LNPs的結構，將空載LNP樣品懸浮在不同比例的D2O/H2O溶劑中(圖2a)，收集VSANS數據，確定LNP核心和殼層內的脂質分布。根據VSANS數據擬合結果，提出了空載LNPs的核心-殼層結構模型(圖2b），詳細確定了核心和殼層的體積分數、溶劑含量及脂質組成等參數。
 

圖2. VSANS對空載LNPs的結構表征

三、NanoFCM檢測空載LNPs的比例
為獲得mRNA-LNPs的結構信息，首先需要確定mRNA-LNP樣品中空載LNPs的占比。對此，作者利用NanoFCM在單個納米顆粒水平上對LNPs進行表征。通過核酸染料標記，可在mRNA-LNP樣品中同時觀察到側向散射和熒光信號，而在空載LNPs中僅檢測到側向散射信號。根據信號數量可分析mRNA-LNP樣品中空載LNPs的比例，結果為27.6±2.9%(圖3a)。此外，通過納米流式的熒光定量分析功能計算出mRNA-LNPs的平均負載為2.9±0.1個mRNA分子(圖3b)。需要注意的是，每個LNP中封裝的核酸分子數量與其長度高度相關。對于包封較短的siRNA的LNPs，每個LNP可以封裝數百個siRNA分子。而對于mRNA，當長度超過2,000個核苷酸時，推測每個LNP中封裝的mRNA分子數量將少于三個。這些結果為理解mRNA-LNPs的組成和結構特征提供了重要的信息，有助于進一步優化其在基因治療和疫苗開發中的應用。通過精確測定空載LNPs的比例和mRNA的負載，我們也能夠更好地評估LNPs的制備工藝和其生物學性能。
 

圖3. 通過NanoFCM檢測LNPs的滿殼率和mRNA拷貝數

四、mRNA-LNPs的結構表征
基于NanoFCM分析得到的信息，從混合樣本的SANS數據中扣除空載LNPs的貢獻后，得到了純mRNA-LNPs的結構信息。結果顯示，mRNA-LNPs的脂質分布、殼層厚度與空載LNPs相似，但溶劑含量更高，導致核心尺寸更大。此外，分析得出，每個mRNA-LNP中平均含有3.2±0.2個mRNA分子，這與NanoFCM測定結果一致，進一步驗證了結構模型的準確性。基于以上結果，作者提出了mRNA-LNPs的精確模型（圖4）。
 

圖4. 根據 VSANS 擬合結果提出的 mRNA-LNPs 結構模型

研究意義
本文深入研究了mRNA-LNPs的結構，揭示了空載LNPs在樣品中的占比及其對結構表征的影響，糾正了以往研究中可能存在的結構模型偏差。通過結合NanoFCM和SANS技術，精確地表征了mRNA-LNPs的結構，為深入探究其組裝機制、穩定性及與生物分子的相互作用提供了重要信息。這些研究成果有助于優化LNP的脂質配方和制備工藝，提高mRNA的包封效率和細胞內遞送效率，增強疫苗的免疫原性與安全性，降低潛在的不良反應，從而加速mRNA疫苗的開發和應用。同時，對mRNA-LNPs結構的深入理解也為基因治療領域提供了新的思路，有助于提高基因遞送效率，拓展應用范圍，促進納米醫學的發展，為設計更有效的納米藥物載體提供理論依據和技術支持。

展望
隨著核酸納米藥物產業的不斷發展，空載LNPs占比（即空殼率）已逐漸成為其工藝開發和質量控制的關鍵指標。對此，NanoFCM提供了一種快速、高效、高靈敏的解決方案，可在單個LNP水平快速獲得樣品的粒徑分布、顆粒濃度、空殼率、包封率和單個LNP載荷（核酸拷貝數）等信息。如有興趣進一步了解，歡迎聯系我們獲取詳細解決方案。