病毒轉染，是以病毒載體介導的一種高效的細胞轉染技術，其將外源基因包裝到病毒的外殼中，利用病毒的天然感染性，從而將外源基因導入宿主細胞當中，使外源基因在細胞中穩定表達。根據病毒載體不同，常見的分為腺病毒（Adenovirus，ADV）、慢病毒（Lentivirus，LV）、逆轉錄病毒（Retrovirus，RV）、腺相關病毒（AAV）。目前實驗室用的比較多，使用范圍廣的是慢病毒，接下來，我們就講講慢病毒。

一 、慢病毒結構

慢病毒是以HIV-1為基礎發展起來的基因治療載體，是一種有包膜的RNA病毒，直徑為80-120nm，呈二十面體對稱球形結構。病毒顆粒最外層是包膜(包膜蛋白決定了感染細胞的類型)，往內依次為基質蛋白和衣殼，最里面是兩條相同的正股RNA鏈和一些酶，包括逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶。

▲慢病毒結構示意圖

慢病毒含有復雜的基因組。以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為例，HIV-1是一種單鏈RNA病毒，共有9個基因。基因組兩端各有一個反向末端重復序列(LTR)，中間包括gag、 pol、env 3個編碼病毒的結構基因，tat、rev2個調節基因， vif、vpr、vpu、nef 4 個輔助基因。隨著對慢病毒基因組的深入研究以及轉染技術的發展，人們對慢病毒基因組進行編輯，將其基因分布在不同的質粒中，在安全性和包裝能力方面不斷改進，從而衍生了第一代、第二代、第三代慢病毒系統。其中第二代三質粒系統和第三代的四質粒系統是目前大家應用比較多，比較廣的。以第二代的三質粒系統為例，該系統包含1個包裝質粒—編碼Gag、Pol、Rev 和Tat 基因, 產生病毒顆粒；一個包膜質粒—Env或VSV-G表達病毒糖蛋白,提供受體結合蛋白；以及一個穿梭質粒—帶有外源目的基因。下圖是第二代和第三代慢病毒質粒包裝系統示意圖。

圖左：第二代慢病毒包裝系統示意圖

圖右：第三代慢病毒包裝系統示意圖

詳細查看點擊下方鏈接：

https://www.addgene.org/guides/lentivirus/

二、慢病毒復制包裝

為了使靶細胞轉染效率更高，前期需要獲得高滴度的慢病毒，也就是需要進行慢病毒的復制包裝。通常情況下，將3質粒按照一定比例添加，共同轉染到293T細胞中孵育，48-72小時后，將含有該病毒的上清液離心收集，或進一步濃縮病毒。

▲慢病毒結構示意圖

三、慢病毒感染細胞過程

慢病毒感染細胞的第一步是通過其表面的包膜蛋白與宿主細胞吸附并與表面受體結合。與宿主細胞膜融合后，釋放病毒內部的結構蛋白、酶蛋白以及病毒核心。在逆轉錄酶的作用下，慢病毒RNA逆轉錄并與整合酶形成整合前復合物。隨之整合前復合物進入宿主細胞核后，整合酶催化其整合至宿主細胞基因組。最后外源基因前啟動子驅動其在宿主細胞質中表達。

▲慢病毒感染宿主細胞示意圖

四、常見慢病毒轉染類型

1、慢病毒熒光轉染
細胞轉染一些標記的熒光基團(GFP/mCherry/RFP等)，篩選出來的目的細胞帶有熒光蛋白。細胞在吸收熒光激發能量后，電子從基態躍遷到激發態，當其恢復至基態時，以發射光形式釋放出能量，發射出一定波長的光。可以通過倒置熒光顯微鏡或者流式細胞儀檢測其轉染后熒光強度來檢驗轉染效率。

2、慢病毒Luciferase化學發光轉染

將攜帶熒光素酶編碼基因(Luc)的質粒轉染入細胞或者導入研究動物體內后，會產生熒光素酶(一種可以催化熒光素底物產生熒光的酶)。加入熒光素(底物)，在ATP和熒光素酶的作用下，熒光素(底物)能夠被氧化發出綠色或黃色熒光。通過高靈敏生物發光成像技術檢測檢測光強度變化。尤其是檢測活體動物體內腫瘤的生長、轉移發展過程。

3、慢病毒細胞永生化轉染

體外分離培養的原代細胞，通過某種方法如病毒感染、輻射或者化學致癌作用，打破細胞原有的分裂次數限制，使其獲得一定分裂生長的能力，延緩細胞衰老死亡。利用慢病毒轉染技術將外源性永生化基因導入目的細胞內，從而獲得具有無限增殖能力且細胞間無差異的永生化細胞株。 

我們尚恩生物公司對常用的細胞系，原代細胞進行慢病毒轉染，包括細胞慢病毒轉染綠色熒光蛋白（ZsGreen）或者紅色熒光蛋白（mCherry、RFP）、細胞慢病毒轉染化學發光LUC、細胞慢病毒SV40永生化轉染，總共近40種穩轉細胞系。也可以進行指定細胞的慢病毒轉染。

 

左：HEK293-GFP-40X

右：143B-GFP-100X

 

左：HCT116-GFP-40X         

右：HUVEC SV40-GFP-100X

 

左：4T1-GFP-100X   

右：A549-RFP-100X

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