UP.SIGHT 2.0 雙重驗證技術賦能單克隆細胞株開發，單克隆性超99.99%
單克隆細胞株的開發在生物制藥生產（如單克隆抗體制備）中占據關鍵地位。為了確保產品的一致性，所使用的細胞株必須來源于單個細胞。常見的克隆工作流程通常包括一至兩輪的單細胞克隆，隨后通過孔板成像確認單細胞是否成功分配。然而，傳統的有限稀釋法或流式細胞術等方法并不能有效驗證是否僅分配了單個細胞，這使得單克隆性的確認過于依賴孔板成像的準確性。孔板成像在細胞檢測時存在固有誤差，同時需要依賴離心操作以確保所有細胞位于成像焦平面內。這些誤差的累積降低了在特定工作流程中實現單克隆性的可能性，因此，高精度的成像技術和檢測方法顯得尤為重要。
UP.SIGHT 2.0 （影像式單細胞打印與成像系統）通過雙重驗證機制有效解決了細胞分配中的挑戰。該系統的第一次驗證是通過一系列噴嘴圖像記錄單細胞的分離情況，第二次驗證則采用3D全孔成像技術直接捕獲液體體積的圖像。這種3D成像技術能夠完整捕捉液體體積，從而避免了克隆后所需的離心操作。此外，UP.SIGHT 2.0還支持菌落生長后的實時監測，兼容96、384和1536孔板，適用于高通量工作流程，且單細胞分配效率超過98%。
圖1. UP.SIGHT 2.0
本研究分析了4000個單細胞和近1000個生長的菌落，結果表明：結合噴嘴圖像與3D全孔成像，細胞株的單克隆性概率超過99.99%，且無需依賴熒光染色或成像技術。
結果展示
1. 在一個設備中提供單細胞分配、孔內驗證和菌落跟蹤功能
UP.SIGHT 2.0為克隆、克隆驗證和追蹤提供了一個完整的工作流程（圖2）。流程的第一步是將細胞懸浮液加載到設備中的一次性墨盒中。在單細胞分配過程中，噴嘴會生成微型自由飛行液滴，并持續進行成像（圖2.1）。圖像處理算法實時評估即將到來的液滴，判斷其是否包含0、1或多個細胞。如果液滴被判定為包含0、多個細胞，或盡管只含一個細胞但其特征（如大小、圓度或熒光強度）不符合預設標準，該液滴將被丟棄。相反，若檢測到1個單細胞，且該細胞的大小、圓度和熒光強度等均符合標準，則該細胞將被分配至孔板中。針對每個成功分配的單細胞，系統會生成五張圖像，以確認單細胞的分離與排出情況。分配完成后，使用孔板下方的第二臺相機進行 3D 全孔成像，捕獲孔中的一系列圖像（圖2.2），這一成像設備為目標孔中分配的單細胞提供了二次確認。
3D全孔成像捕獲的圖像數量取決于板的類型和孔中介質的體積，這種成像方式消除了對孔板進行離心的需求。由于成像是細胞在介質中沉降時進行的，而細胞通常位于液體體積的上半部分，因此與僅在孔底進行第0天成像相比，這種方式大大減少了由于板或邊緣效應造成的畸變影響，從而提升了細胞檢測的準確性。
在克隆后的階段，UP.SIGHT 2.0能夠對具有理想生長曲線的特定克隆進行成像并追蹤其群體生長（圖2.3）。圖3展示了一個經過驗證為源自單個細胞的群體，該驗證是通過噴嘴影像及第0天的3D全孔成像完成。展示了細胞在底部沉淀后的狀態，以及在分配事件后的第1天、第4天和第7天所拍攝的后續影像。整個成像過程快速且高效，僅需約3分鐘即可處理一個384孔的板，從而實現后續的高通量群體追蹤。
圖2.UP.SIGHT 2.0對于每個孔的工作流程
1）通過噴嘴成像可以驗證分配的液滴中僅包含單個細胞，2）對分配后的孔進行一系列3D全孔成像，以做第二次驗證，3）對隨時間生長的菌落進行成像以確保克隆性的一致性。
圖3.UP.SIGHT在菌落生長追蹤中的應用，分別為第0、1、4和7天的菌落成像。
2. 噴嘴圖像與3D全孔成像相結合，為單克隆性細胞分配提供了多重保證
噴嘴圖像與3D全孔成像的結合進一步驗證了細胞在孔板中的分布情況。與有限稀釋法或流式細胞術等傳統方法相比，UP.SIGHT 2.0在單細胞分配過程中提供了更可靠的驗證，單細胞分配效率超過98%。然而，算法在某些情況下可能會誤判為僅分配了一個細胞，而實際上可能是兩個相互粘連的細胞。因此，引入3D全孔成像為單細胞分配的確認提供了第二種方法，以確保僅有一個細胞被分配。
圖4展示了兩個噴嘴圖像及其相應的3D全孔成像示例。在這些示例中，紅色和綠色CHO細胞被混合并分配，所形成的菌落也被熒光成像儀捕捉到。在圖4.1中，噴嘴圖像清晰顯示僅選擇了一個細胞，3D全孔成像顯示的單個細胞和單色菌落進一步驗證了這一點，證實這是一個單克隆細胞系。而在圖4.2中，僅憑噴嘴圖像難以確認是否僅選擇了一個細胞，而3D全孔成像則清楚地證實分配了兩個細胞，并且這兩個細胞分別生成了紅色和綠色的菌落。在這個例子中，噴嘴圖像與3D全孔成像的結合幫助判定這是一個非克隆的細胞群體，并將其排除在進一步分析之外。
圖4.UP.SIGHT通過噴嘴和3D全孔成像為克隆性提供多種保證
3. 實現>99.99%的單克隆概率
為確定UP.SIGHT 2.0實現單克隆性的概率，我們計算了噴嘴圖像和3D全孔成像相關的誤差率。本研究采用紅色和綠色1:1混合的CHO細胞，評估單細胞分配和3D全孔成像的錯誤率。
根據噴嘴圖像將4000多個細胞分配到孔板中，以確定噴嘴圖像的誤差率。驗證孔板中的細胞后發現，41個孔實際上包含兩個細胞，因此可以確認噴嘴圖像的誤差率為1.0%。
對于3D全孔成像的誤差率，我們保留了一部分孔板用于菌落評估，并將3D全孔圖像中標記為單個細胞的孔與實際獲得的菌落進行比較。紅色和綠色細胞均被沉積，因此任何含有多色菌落的孔都表明存在3D全孔成像誤差。經過評估，1800多個孔中得出了991個菌落，其中有2個混合顏色的菌落被錯誤分類。由此，3D全孔成像的誤差率估計為0.7%。將這兩個誤差率相乘，得出UP.SIGHT 2.0提供的單克隆性概率超過99.99%。盡管在3D全孔圖像中無法將兩個混合顏色的菌落識別為非克隆菌落，但在相應的噴嘴圖像中，這兩個孔均能被識別為非克隆。
4. 部分3D全孔成像不僅提供了>99.99%的單克隆性概率，還顯著提升了成像速度
在3D全孔成像過程中，細胞聚焦的圖像堆疊位置在各孔板之間保持一致。此過程中共獲取了81張圖像，以全面覆蓋孔體積。對1500多個孔的評估顯示，細胞的平均位置位于圖像堆疊的第65層（圖像1為孔底，圖像81為液體頂部），其標準偏差為4.2，最小值為第45張圖像。這些變化主要源于孔底高度的不一致及移液過程中的誤差。由于細胞沉降速度較慢，細胞在分配后不太可能立即位于孔板的下部。因此，可以省略對孔底的成像，從中間層開始拍攝至液體頂部，從而有效減少處理時間，同時保持較高的單克隆性概率。表2展示了384孔板示例中每個孔的細胞聚焦圖像堆疊位置。盡管捕獲了81張圖像，但從液體體積中心開始的40幅圖像已足以捕捉所有細胞，并實現與3D全孔成像相同的單克隆性概率。表3對不同工作流程進行了比較，展示了各自的處理時間和單克隆性概率。 
表2.在3D全孔成像中，從液體體積中心成像仍然可以捕獲細胞，并保持高概率的單克隆性。81張圖像覆蓋整個體積，細胞通常在圖像55至70間可見。由于細胞沉降緩慢，僅需從中心開始的40張圖像，無需評估孔的下半部分。
表3.工作流程處理時間的比較
實驗結論
UP.SIGHT 2.0是一種多功能設備，具備單細胞的分離、驗證與菌落生長監測能力。其創新的3D全孔成像技術為每個孔提供全面的液體體積成像，完全不依賴離心孔板進行單細胞分配驗證，這一創新顯著提升了實驗的靈活性和準確性。
通過對單細胞的成像與記錄，UP.SIGHT 2.0為克隆性驗證提供了可靠的雙重保障。以上研究對超過4000個單細胞進行了深入驗證，結果顯示該工作流程實現了超過99.99%的單克隆率。此外，部分3D全孔成像結果顯示，單克隆性的概率也超過99.99%，并且成像速度顯著提高，這進一步增強了實驗效率和可靠性。
總之，UP.SIGHT 2.0不僅提升了單細胞研究的準確性和效率，還為未來的細胞生物學研究提供了強有力的工具支持。這一技術的出現，將推動細胞研究領域的發展，為深入理解細胞行為與特性奠定基礎。
UP.SIGHT 2.0 （影像式單細胞打印與成像系統）通過雙重驗證機制有效解決了細胞分配中的挑戰。該系統的第一次驗證是通過一系列噴嘴圖像記錄單細胞的分離情況，第二次驗證則采用3D全孔成像技術直接捕獲液體體積的圖像。這種3D成像技術能夠完整捕捉液體體積，從而避免了克隆后所需的離心操作。此外，UP.SIGHT 2.0還支持菌落生長后的實時監測，兼容96、384和1536孔板，適用于高通量工作流程，且單細胞分配效率超過98%。
圖1. UP.SIGHT 2.0
本研究分析了4000個單細胞和近1000個生長的菌落，結果表明：結合噴嘴圖像與3D全孔成像，細胞株的單克隆性概率超過99.99%，且無需依賴熒光染色或成像技術。
結果展示
1. 在一個設備中提供單細胞分配、孔內驗證和菌落跟蹤功能
UP.SIGHT 2.0為克隆、克隆驗證和追蹤提供了一個完整的工作流程（圖2）。流程的第一步是將細胞懸浮液加載到設備中的一次性墨盒中。在單細胞分配過程中，噴嘴會生成微型自由飛行液滴，并持續進行成像（圖2.1）。圖像處理算法實時評估即將到來的液滴，判斷其是否包含0、1或多個細胞。如果液滴被判定為包含0、多個細胞，或盡管只含一個細胞但其特征（如大小、圓度或熒光強度）不符合預設標準，該液滴將被丟棄。相反，若檢測到1個單細胞，且該細胞的大小、圓度和熒光強度等均符合標準，則該細胞將被分配至孔板中。針對每個成功分配的單細胞，系統會生成五張圖像，以確認單細胞的分離與排出情況。分配完成后，使用孔板下方的第二臺相機進行 3D 全孔成像，捕獲孔中的一系列圖像（圖2.2），這一成像設備為目標孔中分配的單細胞提供了二次確認。
3D全孔成像捕獲的圖像數量取決于板的類型和孔中介質的體積，這種成像方式消除了對孔板進行離心的需求。由于成像是細胞在介質中沉降時進行的，而細胞通常位于液體體積的上半部分，因此與僅在孔底進行第0天成像相比，這種方式大大減少了由于板或邊緣效應造成的畸變影響，從而提升了細胞檢測的準確性。
在克隆后的階段，UP.SIGHT 2.0能夠對具有理想生長曲線的特定克隆進行成像并追蹤其群體生長（圖2.3）。圖3展示了一個經過驗證為源自單個細胞的群體，該驗證是通過噴嘴影像及第0天的3D全孔成像完成。展示了細胞在底部沉淀后的狀態，以及在分配事件后的第1天、第4天和第7天所拍攝的后續影像。整個成像過程快速且高效，僅需約3分鐘即可處理一個384孔的板，從而實現后續的高通量群體追蹤。
圖2.UP.SIGHT 2.0對于每個孔的工作流程
圖3.UP.SIGHT在菌落生長追蹤中的應用，分別為第0、1、4和7天的菌落成像。
2. 噴嘴圖像與3D全孔成像相結合，為單克隆性細胞分配提供了多重保證
噴嘴圖像與3D全孔成像的結合進一步驗證了細胞在孔板中的分布情況。與有限稀釋法或流式細胞術等傳統方法相比，UP.SIGHT 2.0在單細胞分配過程中提供了更可靠的驗證，單細胞分配效率超過98%。然而，算法在某些情況下可能會誤判為僅分配了一個細胞，而實際上可能是兩個相互粘連的細胞。因此，引入3D全孔成像為單細胞分配的確認提供了第二種方法，以確保僅有一個細胞被分配。
圖4展示了兩個噴嘴圖像及其相應的3D全孔成像示例。在這些示例中，紅色和綠色CHO細胞被混合并分配，所形成的菌落也被熒光成像儀捕捉到。在圖4.1中，噴嘴圖像清晰顯示僅選擇了一個細胞，3D全孔成像顯示的單個細胞和單色菌落進一步驗證了這一點，證實這是一個單克隆細胞系。而在圖4.2中，僅憑噴嘴圖像難以確認是否僅選擇了一個細胞，而3D全孔成像則清楚地證實分配了兩個細胞，并且這兩個細胞分別生成了紅色和綠色的菌落。在這個例子中，噴嘴圖像與3D全孔成像的結合幫助判定這是一個非克隆的細胞群體，并將其排除在進一步分析之外。
圖4.UP.SIGHT通過噴嘴和3D全孔成像為克隆性提供多種保證
3. 實現>99.99%的單克隆概率
為確定UP.SIGHT 2.0實現單克隆性的概率，我們計算了噴嘴圖像和3D全孔成像相關的誤差率。本研究采用紅色和綠色1:1混合的CHO細胞，評估單細胞分配和3D全孔成像的錯誤率。
根據噴嘴圖像將4000多個細胞分配到孔板中，以確定噴嘴圖像的誤差率。驗證孔板中的細胞后發現，41個孔實際上包含兩個細胞，因此可以確認噴嘴圖像的誤差率為1.0%。
對于3D全孔成像的誤差率，我們保留了一部分孔板用于菌落評估，并將3D全孔圖像中標記為單個細胞的孔與實際獲得的菌落進行比較。紅色和綠色細胞均被沉積，因此任何含有多色菌落的孔都表明存在3D全孔成像誤差。經過評估，1800多個孔中得出了991個菌落，其中有2個混合顏色的菌落被錯誤分類。由此，3D全孔成像的誤差率估計為0.7%。將這兩個誤差率相乘，得出UP.SIGHT 2.0提供的單克隆性概率超過99.99%。盡管在3D全孔圖像中無法將兩個混合顏色的菌落識別為非克隆菌落，但在相應的噴嘴圖像中，這兩個孔均能被識別為非克隆。
4. 部分3D全孔成像不僅提供了>99.99%的單克隆性概率，還顯著提升了成像速度
在3D全孔成像過程中，細胞聚焦的圖像堆疊位置在各孔板之間保持一致。此過程中共獲取了81張圖像，以全面覆蓋孔體積。對1500多個孔的評估顯示，細胞的平均位置位于圖像堆疊的第65層（圖像1為孔底，圖像81為液體頂部），其標準偏差為4.2，最小值為第45張圖像。這些變化主要源于孔底高度的不一致及移液過程中的誤差。由于細胞沉降速度較慢，細胞在分配后不太可能立即位于孔板的下部。因此，可以省略對孔底的成像，從中間層開始拍攝至液體頂部，從而有效減少處理時間，同時保持較高的單克隆性概率。表2展示了384孔板示例中每個孔的細胞聚焦圖像堆疊位置。盡管捕獲了81張圖像，但從液體體積中心開始的40幅圖像已足以捕捉所有細胞，并實現與3D全孔成像相同的單克隆性概率。表3對不同工作流程進行了比較，展示了各自的處理時間和單克隆性概率。
表2.在3D全孔成像中，從液體體積中心成像仍然可以捕獲細胞，并保持高概率的單克隆性。81張圖像覆蓋整個體積，細胞通常在圖像55至70間可見。由于細胞沉降緩慢，僅需從中心開始的40張圖像，無需評估孔的下半部分。
表3.工作流程處理時間的比較
實驗結論
UP.SIGHT 2.0是一種多功能設備，具備單細胞的分離、驗證與菌落生長監測能力。其創新的3D全孔成像技術為每個孔提供全面的液體體積成像，完全不依賴離心孔板進行單細胞分配驗證，這一創新顯著提升了實驗的靈活性和準確性。
通過對單細胞的成像與記錄，UP.SIGHT 2.0為克隆性驗證提供了可靠的雙重保障。以上研究對超過4000個單細胞進行了深入驗證，結果顯示該工作流程實現了超過99.99%的單克隆率。此外，部分3D全孔成像結果顯示，單克隆性的概率也超過99.99%，并且成像速度顯著提高，這進一步增強了實驗效率和可靠性。
總之，UP.SIGHT 2.0不僅提升了單細胞研究的準確性和效率，還為未來的細胞生物學研究提供了強有力的工具支持。這一技術的出現，將推動細胞研究領域的發展，為深入理解細胞行為與特性奠定基礎。
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