親和蛋白純化是一種基于蛋白質(zhì)與特定配體之間的特異性結(jié)合的純化技術(shù)，廣泛用于分離具有生物學(xué)功能的目標(biāo)蛋白。以下是具體實驗步驟：

以下所用的儀器為輝因科技的蛋白純化系統(tǒng)Hass25，具體配置為：雙泵梯度，最大流速25mL/min,多波長190-500nm的檢測器。雙板位收集器。圖為以下：

Hass25 蛋白純化系統(tǒng)

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1. 實驗原理

親和純化利用目標(biāo)蛋白和配體之間的高特異性相互作用，將目標(biāo)蛋白從復(fù)雜的混合物（如細胞裂解液）中分離出來。常見配體包括抗體、金屬離子、底物類似物等。

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2. 實驗材料與設(shè)備
材料：

• 待純化的蛋白質(zhì)樣品：如細胞裂解液、培養(yǎng)上清等。
• 親和層析柱：選擇與目標(biāo)蛋白特異結(jié)合的填料。
  • 常見填料類型：
    • 抗體（如Protein A/G柱，用于抗體純化）
    • Ni²⁺或Co²⁺（金屬離子柱，用于His標(biāo)簽蛋白純化）
    • GST（谷胱甘肽柱，用于GST標(biāo)簽蛋白純化）
    • Lectin（用于糖蛋白純化）
• 緩沖液：
  • 平衡緩沖液（Binding Buffer）
  • 洗脫緩沖液（Elution Buffer）
  • 洗滌緩沖液（Wash Buffer）

 

設(shè)備：

• 層析系統(tǒng)（如FPLC, 實驗所用儀器為輝因科技的HassPure25）
• 離心機
• 超聲波破碎儀（如需裂解細胞）
• UV檢測器（檢測蛋白的洗脫峰）

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3. 實驗步驟
Step 1. 樣品制備

1. 裂解細胞或組織，提取蛋白。

• 裂解緩沖液：含有適量的蛋白酶抑制劑，防止蛋白降解。
• 超聲波、反復(fù)凍融或機械方法破碎細胞。

 

1. 離心去除細胞碎片，收集上清液（含目標(biāo)蛋白）。

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Step 2. 層析柱的準(zhǔn)備

1. 平衡親和柱：

• 用平衡緩沖液（如含20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4）多次沖洗親和柱。
• 確保柱內(nèi)環(huán)境適合目標(biāo)蛋白結(jié)合。

 

1. 預(yù)洗柱子（可選）：

• 使用去離子水或低濃度洗滌液去除填料中的雜質(zhì)。

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Step 3. 蛋白結(jié)合

1. 將樣品緩慢加載到親和柱上（流速低于0.5 mL/min）。
2. 保證目標(biāo)蛋白與填料上的配體充分結(jié)合。

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Step 4. 洗滌雜質(zhì)

1. 用洗滌緩沖液沖洗柱子，去除非特異性結(jié)合的蛋白。
2. 檢測流出液中的蛋白含量（如280 nm吸光度），確保雜質(zhì)被洗脫。

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Step 5. 蛋白洗脫

1. 使用洗脫緩沖液破壞目標(biāo)蛋白與配體的結(jié)合：

• 常見洗脫方式：
  • 改變pH值（如加入低pH緩沖液）。
  • 添加競爭性配體（如谷胱甘肽）。
  • 使用高鹽濃度或變性劑（如尿素、鹽酸胍）。

1. 收集洗脫液中的目標(biāo)蛋白（分段收集以確保分離純度）。

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Step 6. 后續(xù)處理

1. 緩沖液更換：通過透析或超濾，將蛋白換入適合后續(xù)實驗的緩沖液中。
2. 濃縮蛋白：使用超濾管濃縮蛋白。
3. 蛋白純度檢測：

• SDS-PAGE（蛋白電泳）
• Western Blot（驗證特異性）
• 活性檢測（如果蛋白有酶活性）。

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4. 注意事項

1. 樣品保護：避免目標(biāo)蛋白變性，保持低溫（4°C）。
2. 避免污染：確保柱子、緩沖液和設(shè)備的清潔。
3. 填料選擇：根據(jù)蛋白的標(biāo)簽或特性選擇適合的親和柱。
4. 蛋白保存：洗脫后的蛋白應(yīng)迅速存儲（如-80°C），避免降解。

如果有具體的實驗條件或目標(biāo)蛋白信息，可以進一步優(yōu)化流程！對于實驗來說，雖然影響因素眾多，但是穩(wěn)定性高，輸出一致性好的儀器也是很重要的。

實驗數(shù)據(jù)最后結(jié)果如下：