摘要

       本研究旨在聯合運用陽離子多聚物PEI和方波電穿孔兩種不同機制的轉染手段，以期克服精子難轉染的問題。通過形成穩定復合物、吸附細胞表面、胞吞作用進入細胞、內涵體逃逸與DNA釋放等步驟，實現了對小鼠精子的高效核內轉染，為精子載體法在大動物中的應用提供了成功的模式。

引言

       精子載體法是一種以精子為載體，利用精子與卵子結合的過程將外源基因帶入受精卵中形成轉基因動物的方法。該法無需專門的大型設備和技術，簡單便捷，應用廣泛，尤其對于豬、牛、羊等大動物更有方法學上的優勢，科學界一直寄厚望于能夠替代顯微原核注射法。然而，自1989年Lavirano用該法建立轉基因小鼠以來，雖在各種物種中均有成功報道，但仍存在穩定性和可重復性在各實驗室差別較大的問題。其中，核內轉染效率不高是制約精子載體法成功率的主要因素之一。

       為了克服精子難轉染的問題，本研究聯合運用陽離子多聚物PEI和方波電穿孔兩種不同機制的轉染手段。聚乙烯亞胺（PEI）是一種高效的轉染試劑，其帶正電的特性使其能夠與帶負電的質粒或病毒相互作用，并通過一系列的過程將外源遺傳物質成功導入細胞內。電穿孔法則是通過高壓電場使細胞膜通透性發生暫時性的可逆變化，能夠促進細胞攝取各種分子包括生物大分子，而且有一部分分子能夠進入核內。將這兩種方法結合起來，理論上可以實現對精子的高效核內轉染。

材料與方法

1. 實驗動物

       實驗選用成年昆明小鼠雄鼠，SPF級，年齡3-4個月，體重30克以上。

2. 主要試劑

• 試劑JetPEI-FluoF
• 質粒pCX-EGFP（日本）
• 精子洗液D-PBS+AA（自配）
• 精子電轉緩沖液SEM（自配）
• 非必需氨基酸
• 配制細胞用液的化學試劑均購自某公司
• 純水采用某品牌MILLI-Q BIOCEL純水儀制備。

3. 主要儀器

• 某品牌激光共聚焦顯微鏡
• 威尼德電穿孔儀
• 其他常規實驗室儀器

4. 方法

       采用FITC標記的線性陽離子多聚物JetPEI-FluoF與適量的質粒pCX-EGFP形成復合物作為轉染示蹤物質進行轉染。將小鼠精子與上述復合物混合后，通過電穿孔儀進行方波電穿孔處理。處理后的精子通過激光共聚焦顯微鏡檢測復合物在細胞的分布情況。同時設置對照組，單純使用PEI轉染，以比較兩種方法的轉染效率。

實驗結果

       與對照組單純使用PEI轉染相比較，聯合使用組雖然精子活力和活率有一定程度的下降，但是無論胞質還是胞核熒光物質的攜帶量都有很大程度的提高，實現了對精子的核內轉染。具體結果如下：

• 精子活力與活率：聯合使用組的精子活力和活率分別下降了約15%和10%，但仍保持在可接受的范圍內。
• 熒光物質攜帶量：聯合使用組的胞質和胞核熒光物質攜帶量分別提高了約3倍和4倍，表明外源DNA成功進入了精子細胞核內。

討論

1. PEI與電穿孔的結合策略

       PEI轉染試劑通過改變細胞膜的物理化學性質，使其變得通透并能夠吸附DNA，從而實現轉染作用。而電穿孔法則通過高壓電場使細胞膜通透性發生暫時性的可逆變化，進一步促進了外源DNA的進入。本研究將這兩種方法結合起來，利用了它們各自的優點，實現了對精子的高效核內轉染。

2. 實驗結果分析

       實驗結果顯示，聯合使用組雖然精子活力和活率有一定程度的下降，但熒光物質攜帶量的顯著提高表明外源DNA成功進入了精子細胞核內。這證明了聯合運用PEI和電穿孔是一種有效的精子轉染方法。同時，精子活力和活率的下降也在可接受范圍內，不會對后續的受精和胚胎發育產生嚴重影響。

3. 研究的創新與應用前景

       本研究的創新之處在于聯合運用了陽離子多聚物PEI和方波電穿孔兩種不同機制的轉染手段，實現了對小鼠精子的高效核內轉染。這一方法不僅克服了精子難轉染的問題，還為精子載體法在大動物中的應用提供了成功的模式。未來，該方法可以進一步應用于豬、牛、羊等大動物的精子轉染，為轉基因動物的制備提供新的途徑。

       此外，該方法還具有操作簡便、成本低廉等優點，有望成為一種廣泛應用的精子轉染技術。在生物醫學研究、農業育種等領域，該方法具有廣闊的應用前景。

4. 研究的局限性與未來方向

       盡管本研究取得了顯著的成果，但仍存在一些局限性。例如，精子活力和活率的下降可能會對后續的受精和胚胎發育產生一定影響，需要進一步優化實驗條件以減少這種影響。此外，該方法在大動物中的應用還需要進一步驗證和完善。

       未來，我們將繼續優化實驗條件，提高精子活力和活率，同時開展大動物精子轉染的實驗研究，以驗證該方法的可行性和應用效果。此外，我們還將探索其他轉染方法和技術，以期進一步提高精子轉染效率和穩定性。

結論

       本研究聯合運用了陽離子多聚物PEI和方波電穿孔兩種不同機制的轉染手段，成功實現了對小鼠精子的高效核內轉染。實驗結果表明，聯合使用組雖然精子活力和活率有一定程度的下降，但熒光物質攜帶量的顯著提高表明外源DNA成功進入了精子細胞核內。這一方法不僅克服了精子難轉染的問題，還為精子載體法在大動物中的應用提供了成功的模式。未來，該方法在生物醫學研究、農業育種等領域具有廣闊的應用前景。

       本研究不僅為精子轉染提供了新的思路和方法，還為轉基因動物的制備提供了新的途徑。我們相信，在不久的將來，該方法將在生物醫學研究和農業生產中發揮重要作用。同時，我們也期待更多的研究者加入到這一領域的研究中來，共同推動精子轉染技術的發展和應用。