肺癌作為全球發病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌（NSCLC）占據了肺癌病例的大多數。在NSCLC的治療中，免疫治療已成為重要手段，而PD-L1的表達水平對于預測免疫治療反應至關重要。準確評估PD-L1表達情況，能夠為患者制定更為精準有效的治療方案。

傳統的評估方法存在一定局限性，而新的研究在這一領域取得了重要進展。今天我們就來深入解讀一項關于優化免疫熒光（IF）與高動態范圍（HDR）成像技術以提升NSCLC腫瘤組織中PD-L1表達評估的研究，看看它為肺癌精準醫療帶來了哪些新的曙光。

研究背景與方法
一、傳統病理檢測方法的現狀與局限
1.免疫組化（IHC）的主導地位
自20世紀中葉以來，H&E染色聯合免疫組化（IHC）一直是標準的病理檢測方法。在NSCLC的診斷中，IHC通過抗體與過氧化物酶激活的顯色底物相互作用，使目標生物標志物沉淀顯色，從而實現可視化定量和分布分析，在診斷新興生物標志物如PD-L1方面發揮著關鍵作用，是指導免疫檢查點治療選擇的重要依據。臨床生物標志物指南目前依賴于可見光染料和模式識別，由經驗豐富的病理學家在明場顯微鏡下對IHC切片進行量化判讀。

2.面臨的挑戰
僅依靠IHC觀察腫瘤空間中異質的PD-L1分布頗具挑戰。腫瘤組織具有高度復雜性和異質性，PD-L1在腫瘤細胞中的表達并非均勻一致，不同區域、不同細胞亞群之間的表達水平可能存在顯著差異，這使得通過傳統IHC方法全面、準確地評估PD-L1表達變得困難重重。

2.實際應用中的阻礙
盡管IF染色在蛋白表達評估方面具有潛力，但在實際病理診斷中仍面臨諸多問題。一方面，與傳統顯微鏡相比，熒光顯微鏡成本效益比和處理程序復雜，限制了其在臨床實踐中的廣泛應用。另一方面，盡管努力優化激發和發射光譜，寬熒光強度范圍仍可能影響成像質量。此外，在高級生物研究中，對熒光圖像的需求急劇增加，而手動解釋暗場（IF）和明場（IHC）圖像之間的相關性因非線性人眼響應而具有挑戰性，迫切需要在可承受的成本下開發先進的探測器用于常規臨床實踐。同時，標準化的染色、成像和數字熒光圖像后處理過程對于使用熒光技術進行常規臨床病理分析至關重要。

2.染色方法
顯色IHC：使用自動染色系統和特定抗體進行。
IF檢測：手動進行，包括抗原修復、與一抗和熒光標記二抗孵育，部分使用酪酰胺信號放大（TSA）系統，還涉及不同組織作為陽性和陰性對照。
3D免疫熒光染色：使用100μm厚的FFPE組織切片，經過脫蠟、抗原暴露、與抗體孵育、染色和透明處理等步驟。
圖像采集與HDR算法：使用掃描儀獲取IHC圖像，采用改進的傳統HDR算法，包括圖像預處理、特定像素采樣、線性縮放和后處理等步驟。
統計分析：通過計算機視覺分析估計和比較PD-L1表達面積比例，由病理學家對PD-L1腫瘤比例評分（TPS）進行判讀、分類和統計分析。

研究結果
一、IF和IHC圖像中PD-L1表達模式對比
1.實驗方法與樣本選擇
為確定一種能產生與臨床IHC檢測質量相當的方法，研究人員比較了熒光2'Ab染色方法和TSA系統在檢測NSCLC標本中PD-L1表達的效果。選取了具有代表性的NSCLC組織區域樣本，包括PD-L1強表達、弱表達以及抗原陰性區域的標本進行實驗。

2.實驗結果與分析
實驗結果顯示，兩種方法在PD-L1強表達區域均呈現出與IHC相當的完整膜性PD-L1模式。結果表明TSA系統在檢測弱表達PD-L1時具有更高的可靠性和特異性，能夠更準確地反映腫瘤組織中PD-L1的真實表達情況，減少假陽性和假陰性結果的出現，為后續的研究奠定了更堅實的基礎。

二、標準IF成像過程中曝光時間的優化
1.曝光時間對成像質量的影響機制
直接影響圖像的對比度和亮度，進而影響對PD-L1表達的觀察和分析。合適的曝光時間能夠確保熒光信號在臨床診斷可接受的范圍內，避免因過亮或過暗而丟失重要信息，同時減少人為因素對熒光信號水平的干擾，保證成像條件的穩定性和可重復性。

2.不同曝光時間下的實驗數據與結論
研究人員測試了低水平（6.5ms）、中等水平（25ms）和高水平（55ms）三種曝光時間對IF圖像中PD-L1表達模式的影響。通過計算機視覺方法計算不同曝光時間下IF圖像中PD-L1表達面積比例，并與相應的IHC圖像進行比較。結果表明，中等曝光時間下的IF圖像與IHC圖像在PD-L1表達面積比例上最為相似，中位數絕對誤差最小（1.16%），與低水平（9.32%）和高水平（12.55%）曝光時間的IF圖像相比具有顯著差異（P<0.0003）。盡管中等曝光時間在一定程度上優化了成像效果，但仍需進一步改進以克服設備動態范圍的限制，實現更準確的PD-L1表達評估。

三、HDR處理對IF圖像動態范圍限制的改善
1.HDR處理的原理與優勢
HDR處理旨在整合同一幻燈片上不同強度的IF數字信號，以克服檢測設備有限動態范圍帶來的挑戰。通過合并不同曝光時間的圖像，HDR算法能夠擴展圖像的動態范圍，使原本因過暗或過亮而丟失的信息得以恢復，從而更全面、準確地呈現PD-L1的表達模式。

2.實驗驗證與效果評估
為驗證HDR算法的有效性，研究人員對圖像進行了有無HDR處理的對比分析，并通過計算機視覺方法比較PD-L1表達面積比例與IHC的相似性。結果顯示，HDR處理后的圖像總體誤差明顯小于未處理圖像，中位數絕對誤差分別為0.15%和1.16%，有效解決了弱信號丟失和過曝光問題。此外，HDR處理還顯著提升了病理學家之間對IF圖像TPS分類的一致性，中等曝光IF圖像經HDR處理后，75%的病例被兩位病理學家分類到相同TPS類別，加權kappa值從0.39提高到0.69。HDR處理不僅提高了單個病理學家對PD-L1表達評估的準確性，還增強了病理學家之間診斷的一致性，減少了主觀差異對診斷結果的影響，為臨床應用提供了更可靠的依據。

四、HDR方法在3D免疫熒光成像中的應用與發現
1.3D免疫熒光成像的實驗過程與技術要點
研究人員將HDR處理應用于3D免疫熒光檢測，以全面展示PD-L1在三維空間中的表達情況。實驗采用100μm厚的FFPE組織切片進行3D免疫熒光染色，經過一系列復雜處理后，利用共聚焦顯微鏡獲取不同深度的圖像，并對感興趣區域（ROI）進行高分辨率采集。通過HDR處理整合各層圖像信息，以揭示PD-L1在腫瘤組織不同深度的真實表達和變化規律。

2.3D免疫熒光成像結果與意義
在3D熒光成像中，研究觀察到了弱信號丟失和強信號過曝光的問題，但經過HDR處理后，IF圖像在PD-L1模式上呈現出完整的著色，清晰顯示出膜染色。通過HDR處理對3D各層圖像的分析，發現腫瘤組織不同深度的PD-L1表達存在顯著差異，如在某樣本中，表層PD-L1 TPS為40%，而底層為15%。HDR處理后的串行圖像經3D渲染后，能夠直觀展示PD-L1在腫瘤組織中的三維分布情況。這一結果強調了HDR處理在2D和3D熒光成像中的重要性，無需進行硬件升級即可顯著提升成像質量，為深入研究腫瘤微環境中PD-L1的分布提供了有力工具，有助于更全面地理解腫瘤生物學行為，為精準治療提供更豐富的信息。

研究結論
一、技術應用與評估效果
TSA系統結合調整成像條件和HDR處理，在NSCLC腫瘤組織中PD-L1表達的2D和3D病理評估中具有良好的臨床應用價值。優化后的數字IF圖像制備過程，在不同深度的肺腫瘤組織中，對于不同水平的PD-L1表達評估展現出較高的準確性和可靠性，其質量與傳統IHC圖像相當，且能提供更精確的PD-L1表達可視化效果，尤其是在展示腫瘤環境不同深度的PD-L1表達變化方面具有獨特優勢，克服了傳統IHC測試在這方面的不足。

二、對肺癌精準醫療的推動作用
1.精準診斷與治療決策
通過更準確地評估PD-L1表達，醫生能夠更精準地判斷患者對免疫治療的反應，從而為患者制定個性化的治療方案。對于PD-L1高表達的患者，免疫治療可能更為有效，而對于低表達患者，則可考慮其他治療策略，避免不必要的治療和副作用，提高治療效果，改善患者預后。

2.深入理解腫瘤生物學行為
3D病理分析PD-L1分布為研究腫瘤微環境提供了更豐富的信息，有助于深入理解腫瘤的發生、發展和轉移機制。這不僅有助于開發新的治療靶點和策略，還能為監測治療反應和疾病進展提供更敏感的指標，推動肺癌精準醫療從診斷到治療的全方位發展。

三、研究的創新點與局限性
1.創新點
本研究的創新之處在于優化了PD-L1 IF檢測的全過程，包括染色、成像和后處理，特別是將HDR算法應用于IF圖像，有效解決了熒光顯微鏡檢測系統動態范圍有限的問題，顯著提高了PD-L1表達評估的準確性和一致性。此外，將該方法成功擴展到3D免疫熒光成像，為研究腫瘤組織中PD-L1的三維分布提供了可行方案，這在以往研究中較少涉及。

2.局限性
盡管取得了重要成果，但研究仍存在一定局限性。例如，研究樣本量相對有限，可能無法完全代表所有NSCLC患者的情況。此外，雖然HDR處理提高了IF圖像的診斷價值，但病理學家對IF圖像的解讀仍不如對IHC圖像熟悉，可能需要額外的培訓和更多的臨床實踐來提高其應用水平。未來研究可進一步擴大樣本量，探索更有效的培訓方法，以推動該技術在臨床實踐中的廣泛應用。

這項研究在NSCLC的PD-L1表達評估領域取得了顯著進展，為肺癌精準醫療帶來了新的希望和方向。通過優化免疫熒光技術與高動態范圍成像的結合，我們在提高PD-L1表達評估準確性方面邁出了重要一步。然而，要將這些研究成果真正轉化為臨床實踐中的有效工具，仍需要廣大科研人員和醫務工作者的共同努力。未來，隨著技術的不斷改進和研究的深入拓展，相信我們將能夠更好地應對肺癌這一重大疾病挑戰，為患者帶來更多的生存希望和生活質量改善的機會。讓我們共同期待在肺癌精準醫療領域取得更多的突破和創新。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：Huang, HN., Kuo, CW., Hung, YL. et al. Optimizing immunofluorescence with high-dynamic-range imaging to enhance PD-L1 expression evaluation for 3D pathology assessment from NSCLC tumor tissue. Sci Rep 14, 15176 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-65187-x.