靶基因甲基化測序(Target-BS)等在揭示特應性皮炎新發現中的應用
特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見的炎癥性皮膚疾病，特征為劇烈瘙癢、復發性濕疹樣病變和Th2介導的免疫反應。調節性T細胞（Regulatory T cell，Treg）在調控炎癥、抑制Th2細胞(T helper 2 cell)和維持免疫穩態中發揮關鍵作用。先前的研究對于AD患者中Treg比例存在沖突結果，一些研究發現Treg比例未改變，而其他研究則報告Treg數量增加。在過敏性疾病中，Treg對Th2細胞的抑制作用被破壞以及Th2型炎癥的促進背后的精確分子機制尚不清楚。因此，探究AD中Treg數量和功能變化背后的分子機制至關重要。
近日，南方醫科大學皮膚病醫院梁云生課題組探討了在特應性皮炎（AD）中，Treg數量和功能變化的分子機制，以及這些變化如何影響Th2型炎癥。相關研究成果以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”為題發表在《Journal of Dermatological Science》期刊。
研究通過流式細胞術、mRNA測序（mRNA-seq）、共培養實驗、共免疫沉淀、染色質免疫沉淀和亞硫酸鹽測序（BS-seq）等方法，在體外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子機制。分析結果表明在輕度和中度AD中檢測到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg數量和CTLA-4表達特征性減少則與血清IL-4 (interleukin-4)水平相關，這與體外高濃度IL-4處理下的驗證分析結果一致。其背后機制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2來抑制Foxp3和CTLA-4位點的轉錄調控。高水平的IL-4破壞了Treg通過CTLA-4介導的Th2細胞分化抑制，而在Treg中阻斷IL-4Rα信號恢復了AD模型小鼠和AD患者的Treg數量和Th2細胞抑制。
總之，本研究結果表明，Treg數量及AD患者嚴重程度分級與血清IL-4水平相關。異常高水平IL-4表觀遺傳調控Treg數量和CTLA-4表達減少。IL-4誘導Treg上的CTLA-4表達減少損害了Th2細胞分化抑制。
研究方法
結果圖形
（1）Treg數量與AD嚴重程度分級和血清中IL-4水平相關。IL-4導致重度AD患者的Treg數量和CTLA-4表達減少。
B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。
C. 重度AD患者和年齡性別匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表達（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中篩選）的代表性流式細胞術和定量分析。
D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表達與血清IL-4水平之間的相關性。
E. 培養的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T細胞中篩選）、CTLA-4+表達（在CD4+ T細胞中篩選）的代表性流式細胞術和定量分析。
（2）IL-4/pSTAT6信號通路如何通過招募DNA甲基轉移酶1（DNMT1）和組蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）來抑制Foxp3和CTLA-4基因位點的轉錄調控。
圖2. IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2來抑制Foxp3和CTLA-4位點的轉錄調控。從健康志愿者（HV）的外周血單個核細胞（PBMCs）中純化出初始T細胞，并在體外用IL-2/TGFβ1培養4天，然后有或沒有高濃度IL-4刺激額外3天。
A. 聚類熱圖顯示培養的Treg中轉錄因子差異表達，其中深紅色表示高基因表達水平。
B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。
C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位點的CpG DNA甲基化，以分析IL-4處理/未處理組Treg的甲基化狀態。圖表顯示通過亞硫酸鹽測序鑒定的DNA甲基化數量。
D. 收集Treg細胞、裂解，并用抗pSTAT6抗體免疫沉淀（IP）。通過免疫印跡法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗體。
E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗體進行ChIP實驗。通過實時PCR檢測Foxp3啟動子和CNS2的免疫沉淀DNA的相對量，并相對于IgG進行歸一化。
F. Treg被轉染HDAC2 siRNA或對照siRNA，并在體外用IL-2/TGFβ1培養4天，然后有或沒有高濃度IL-4刺激額外3天。代表性的流式細胞術和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表達。
G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗體進行ChIP實驗。通過實時PCR檢測Foxp3和CTLA-4啟動子的免疫沉淀DNA的相對量，并相對于IgG進行歸一化。每組n=3，三個重復。
（3）高水平IL-4破壞了CTLA-4介導的Treg對Th2細胞分化的抑制作用。
B. Teffs中IL-4表達的代表性流式細胞術和定量分析。每組n=3，三個重復。
（4）IL-4在AD小鼠模型中破壞了Treg對Th2型炎癥的抑制作用。
B-C. 第16天從整個耳朵和血液中IL-4+表達的代表性流式細胞術和定量分析。
D-E. 第16天從整個耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表達的代表性流式細胞術和定量分析。每組n=3只小鼠，三個重復。
（5）達必妥(Dupilumab) 恢復了重度AD患者的Treg數量和CTLA-4表達，并抑制Th2型炎癥。
圖5. Dupilumab恢復了重度AD患者的Treg數量和CTLA-4表達及其對Th2炎癥的抑制作用。
A. 在不同時間點對AD患者外周血中Foxp3+ CD25+ Treg的代表性流式細胞術和定量分析。
B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式細胞術和定量分析。
C. 在不同時間點對Th2細胞的代表性流式細胞術和定量分析。
易小結
參考文獻：
Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.
近日，南方醫科大學皮膚病醫院梁云生課題組探討了在特應性皮炎（AD）中，Treg數量和功能變化的分子機制，以及這些變化如何影響Th2型炎癥。相關研究成果以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”為題發表在《Journal of Dermatological Science》期刊。
研究通過流式細胞術、mRNA測序（mRNA-seq）、共培養實驗、共免疫沉淀、染色質免疫沉淀和亞硫酸鹽測序（BS-seq）等方法，在體外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子機制。分析結果表明在輕度和中度AD中檢測到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg數量和CTLA-4表達特征性減少則與血清IL-4 (interleukin-4)水平相關，這與體外高濃度IL-4處理下的驗證分析結果一致。其背后機制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2來抑制Foxp3和CTLA-4位點的轉錄調控。高水平的IL-4破壞了Treg通過CTLA-4介導的Th2細胞分化抑制，而在Treg中阻斷IL-4Rα信號恢復了AD模型小鼠和AD患者的Treg數量和Th2細胞抑制。
總之，本研究結果表明，Treg數量及AD患者嚴重程度分級與血清IL-4水平相關。異常高水平IL-4表觀遺傳調控Treg數量和CTLA-4表達減少。IL-4誘導Treg上的CTLA-4表達減少損害了Th2細胞分化抑制。
研究方法
- 研究隊列：42名AD患者和14名健康志愿者（(healthy volunteers，HVs），以及用于實驗的特定基因敲除小鼠。
- 通過MC903誘導AD小鼠模型，評估耳厚度和組織學變化。
- 從人和小鼠樣本中分離和分化細胞，進行Treg抑制實驗和流式細胞術分析。
- 使用ELISA和Western blotting技術分析血清和蛋白表達水平。
- 通過亞硫酸鹽測序（Target-BS）和共免疫沉淀實驗分析DNA甲基化和蛋白相互作用。
- 進行染色質免疫沉淀（ChIP）和RT-qPCR分析特定基因位點的表觀遺傳修飾。
結果圖形
（1）Treg數量與AD嚴重程度分級和血清中IL-4水平相關。IL-4導致重度AD患者的Treg數量和CTLA-4表達減少。
圖1. IL-4水平增加導致重度AD患者中Treg數量和CTLA-4表達減少。
A. AD患者和健康志愿者（HVs）中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD3+ CD4+ T細胞中篩選）的代表性流式細胞術和定量分析。B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。
C. 重度AD患者和年齡性別匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表達（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中篩選）的代表性流式細胞術和定量分析。
D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表達與血清IL-4水平之間的相關性。
E. 培養的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T細胞中篩選）、CTLA-4+表達（在CD4+ T細胞中篩選）的代表性流式細胞術和定量分析。
（2）IL-4/pSTAT6信號通路如何通過招募DNA甲基轉移酶1（DNMT1）和組蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）來抑制Foxp3和CTLA-4基因位點的轉錄調控。
A. 聚類熱圖顯示培養的Treg中轉錄因子差異表達，其中深紅色表示高基因表達水平。
B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。
C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位點的CpG DNA甲基化，以分析IL-4處理/未處理組Treg的甲基化狀態。圖表顯示通過亞硫酸鹽測序鑒定的DNA甲基化數量。
D. 收集Treg細胞、裂解，并用抗pSTAT6抗體免疫沉淀（IP）。通過免疫印跡法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗體。
E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗體進行ChIP實驗。通過實時PCR檢測Foxp3啟動子和CNS2的免疫沉淀DNA的相對量，并相對于IgG進行歸一化。
F. Treg被轉染HDAC2 siRNA或對照siRNA，并在體外用IL-2/TGFβ1培養4天，然后有或沒有高濃度IL-4刺激額外3天。代表性的流式細胞術和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表達。
G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗體進行ChIP實驗。通過實時PCR檢測Foxp3和CTLA-4啟動子的免疫沉淀DNA的相對量，并相對于IgG進行歸一化。每組n=3，三個重復。
（3）高水平IL-4破壞了CTLA-4介導的Treg對Th2細胞分化的抑制作用。
圖3. 高水平IL-4破壞了CTLA-4介導的Treg對Th2細胞分化的抑制作用，OTII小鼠脾臟中分離的CTV標記的CD4+ CD25− Teffs和從BMDCs衍生的DCs與Foxp3YFP/Cre或Il4rafl/fl Tregs以1:1:1的比例共培養2天。
A. CTV標記的Teffs數量和定量。B. Teffs中IL-4表達的代表性流式細胞術和定量分析。每組n=3，三個重復。
（4）IL-4在AD小鼠模型中破壞了Treg對Th2型炎癥的抑制作用。
圖4. IL-4破壞了AD小鼠模型中Treg對Th2型炎癥的抑制作用。
A. 第16天用乙醇（EtOH）或MC903處理的小鼠耳朵的代表性圖像和組織學H&E染色結果。B-C. 第16天從整個耳朵和血液中IL-4+表達的代表性流式細胞術和定量分析。
D-E. 第16天從整個耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表達的代表性流式細胞術和定量分析。每組n=3只小鼠，三個重復。
（5）達必妥(Dupilumab) 恢復了重度AD患者的Treg數量和CTLA-4表達，并抑制Th2型炎癥。
圖5. Dupilumab恢復了重度AD患者的Treg數量和CTLA-4表達及其對Th2炎癥的抑制作用。
B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式細胞術和定量分析。
C. 在不同時間點對Th2細胞的代表性流式細胞術和定量分析。
易小結
- Treg數量和AD的嚴重程度分級與血清IL-4水平相關。
- 異常高水平的IL-4表觀遺傳調控Treg數量和CTLA-4表達減少。
- Treg中由IL-4誘導的CTLA-4表達減少破壞了Th2細胞分化抑制。
- 阻斷Treg中的IL-4Rα信號可以恢復Treg數量和對Th2型炎癥的抑制，為AD治療提供了新的策略和深入的機制理論。
參考文獻：
Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.
標簽：
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