導讀
非小細胞肺癌（NSCLC）是全球范圍內發病率和死亡率最高的癌癥之一，表皮生長因子受體（EGFR）是NSCLC進展重要的驅動基因，其突變狀態與患者療效和預后監測評估密切相關。準確、快速地檢測EGFR突變對于NSCLC的精準治療至關重要。傳統的檢測方法如Sanger測序、ARMS-PCR、NGS等存在靈敏度不足、通量較低或患者負擔較重等局限性問題。

Stilla Technologies研究人員在Lung Cancer Methods and Protocols這本書中編寫了題為“6-Color Crystal Digital PCR™ for the High-Plex Detection of EGFR Mutations in Non-Small Cell Lung Cancer ”的文章。詳細介紹新型的高階多重數字PCR技術用于高通量檢測非小細胞肺癌（NSCLC）中的EGFR基因突變，描述了實驗流程、材料、方法和結果，展示了多重數字PCR系統在快速獲得大量突變信息方面的優勢，凸顯了其在腫瘤基因分型和液體活檢監測中的潛力。

 研究亮點：
本研究采用了先進的6-Color Crystal Digital PCR™技術，實現了EGFR突變的高通量、高靈敏度和高階多重檢測。與傳統技術相比，在檢測精度和多重突變分析能力方面展現出顯著優勢，能夠同時精準定量檢測19種EGFR突變，極大提高了檢測的可靠性和效率，為臨床的決策提供更有效的數據。

 研究結果：
作者優化的高階多重檢測方案（見下圖）能夠單孔內同時檢測五種藥物敏感突變（p.L858R，p.L861Q，p.G719S，p.G719A，p.G719C），12種不同的19號外顯子插入缺失變異，以及兩種耐藥突變（p.T790M和p.C797S），檢測樣本適用于NSCLC患者的腫瘤組織和cfDNA (cell-free DNA)。

▲EGFR 6-Color Crystal Digital PCR™檢測中引物和探針的基因組定位以及擴增子的大小。該6色EGFR檢測試劑包括七個探針，分別針對G719A/C/S、L858R和L861Q敏感性突變以及T790M和C797S耐藥突變。EGFR 19號外顯子插入缺失變異具有可變的基因組序列，采用了drop-off檢測方法。該方法包括一個參考探針，該探針與突變型和野生型等位基因均具有互補性；以及一個drop-off探針，該探針跨越突變位點，但僅與野生型序列互補。在存在野生型等位基因的情況下，兩個探針與其靶標雜交，產生雙陽性信號。然而，在存在突變型等位基因的情況下，只有參考探針而非drop-off探針會與其靶標退火，產生單陽性信號。關于drop-off檢測的更多細節，請參見：https://www.stillatechnologies.com/application-notes/。

作者對9種DNA標準品進行梯度稀釋，每種DNA攜帶一種EGFR突變，背景為WT DNA。通過對該高階多重檢測方案進行測試，檢測到突變頻率在2.5%到0.1%之間時，均具有極好的線性關系（見下圖）。

▲EGFR 6-Color Crystal Digital PCR™檢測的性能。在每25μL反應中含有104拷貝野生型DNA和400拷貝內部陽性對照DNA的背景下，對突變型DNA進行2.5%到0.1%的系列稀釋，每個反應拷貝數的理論和檢測值之間進行線性回歸，得到的R²范圍為0.9917到1。

每個熒光通道陰陽性微滴的熒光閾值設置如下圖所示。設置閾值時，應將陽性和陰性對照的點圖與樣本的點圖一起合并分析。確保在閾值設置后，陽性對照中的陽性微滴可以被正確統計。

▲使用FAM通道（x軸）進行閾值設置：（A）野生型DNA和外顯子19缺失（ATTOTM700通道），（B）L858R、L861Q和G719X突變（Cy®5通道），（C）T790M突變（YY®通道），（D）C797S突變（ROX通道），以及（E）內參（Cy®3通道）。

結論：
6-Color Crystal Digital PCR™技術為非小細胞肺癌患者EGFR突變的檢測提供了一個高效、精準和經濟性的解決方案。其高靈敏度、多重檢測能力和定值準確性，為臨床提供了更可靠的診斷工具，也為患者個性化治療策略的制定提供了堅實的數據支持。隨著技術的進一步優化和推廣，高階多重數字PCR有望成為腫瘤分子診斷領域的重要工具，推動精準醫學在癌癥治療中的應用，幫助醫生更好地實現對患者的全病程管理，為他們制定個性化的治療方案。

參考文獻：
Madic, Jordan, et al. "6-Color Crystal Digital PCR™ for the High-Plex Detection of EGFR Mutations in Non-Small Cell Lung Cancer." Lung Cancer: Methods and Protocols, edited by Pedro G. Santiago-Cardona, vol. 2279, Methods in Molecular Biology, Springer Science+Business Media, 2021, pp. 127-144. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1278-1_10

實體瘤突變檢測可用于患者全病程管理（基因分型、靶向藥檢測、療效和預后評估、復發監測），艾普拜生物已開發測試針對多種樣本類型（體液、新鮮冰凍組織、FFPE）的常見突變數字PCR檢測試劑盒，詳情見下表。