外泌體是細胞分泌的納米級囊泡，它們在細胞間通訊中扮演著關鍵角色，并參與多種生理和病理過程。外泌體不僅攜帶蛋白質、脂質以及核酸等生物分子，還具有穿越多種生物屏障等能力，為靶向藥物遞送和基因治療提供了一個全新的平臺。外泌體工程化技術經由基因改造或化學修飾等手段提高外泌體的生物活性、穩定性以及靶向性，在外泌體藥物遞送及治療應用中具有重要應用前景。其中通過基因工程方式作為內源性工程化外泌體改造的重要方式，在工程化外泌體的開發中備受關注。

近日，北京恩澤康泰生物科技有限公司在外泌體工程化改造領域取得重大進展，其研究成果發表于Journal of Extracellular Vesicles。這一發現拓寬了外泌體支架蛋白的選擇范圍，為外泌體在藥物遞送和基因治療中的應用提供了新的可能性。
 

研究背景
由于外泌體能夠調節受體細胞的生物表型，大家越來越關注其作為新型治療載體的潛力。外泌體具備免疫原性有限、毒性低和跨越血腦屏障能力等優勢，可保護封裝的貨物分子以及體內循環系統的穩定性，克服了合成藥物遞送系統的局限性。但外泌體的臨床應用也面臨諸多挑戰，如給定生物分子含量低、循環時間短、肝臟主導的生物分布等。此外，量產工藝不成熟和缺乏完善的質量控制標準也限制了其發展。為了克服上述的問題，科研人員通過基因工程或化學修飾對外泌體進行工程化改造，以改善其生物活性、載藥能力和靶向性等。改造方法之一是將目標蛋白(protein of interest，POI)通過與支架蛋白融合的方式導入外泌體，實現生成前的蛋白質改造或內源蛋白質改造。這種方法可以實現穩定大批量制備，并根據需要將POI展示在外泌體的表面或內部。目前，常見的外泌體支架蛋白分為三類，分別是四跨膜蛋白(CD63，CD9，CD81等)、膜周蛋白(MFGE8)，以及I型跨膜蛋白(Lamp2b，PTGFRN等)三類。但這些支架蛋白仍存在不足，如四跨膜蛋白的N端和C端均位于膜內，當需要在外泌體的表面展示POI時，只能對外表面的loop結構進行融合改造，加大了分子設計和驗證的難度；膜周蛋白MFGE8與膜表面蛋白的結合力弱，一旦融合分子量較大的POI后，在外泌體上的含量就會迅速降低；Lamp2b適合N端融合，C端融合則會影響其分揀能力。為了讓外泌體工程化改造技術能夠更好地服務于外泌體創新療法的開發，篩選新型支架蛋白的努力從未停止。而此前篩選外泌體支架蛋白的標準主要包括以下四點：

1. 在外泌體上的高水平表達；
2. 較小的分子量；
3. 具有適合的改造位點；
4. 本身不應具有明顯的生物學功能。

然而，能夠同時滿足上述四個條件的候選蛋白數量有限。因此，本文的研究者在此研究策略之上，將支架蛋白的篩選標準進行了大幅度的精簡，從之前的四個減少到以下兩個：

1. 必須是具有外泌體主動分揀能力的I型跨膜蛋白；
2. 在該蛋白的N端以及C端進行截短或融合等改造不會顯著影響該蛋白向外泌體分揀的能力。

一、PLXNA1的篩選與鑒定
研究者首先通過高分辨蛋白組學技術對EV中不同蛋白質的分揀能力進行了初步評估。結果顯示，叢蛋白A1(PLXNA1)與經典的外泌體富集蛋白(MFGE8、CD81、PTGFRN以及SDCBP等)類似，其相對豐度在細胞裂解液(CL)、初純外泌體(UC)和高純外泌體(DGC)之中依次呈現出由低到高的趨勢，而與外泌體樣本中常見的污染蛋白(CANX)呈現出相反的趨勢(圖1c)。并且其在外泌體中的富集程度相較于細胞裂解液有了顯著提升，其增加的倍數在所有比較的外泌體富集蛋白中排名第二，僅次于MFGE8(圖1d)。且該結果得到Western Blot(WB)驗證(圖1e)。這些結果表明PLXNA1滿足了研究者設定的第一個篩選標準，即具有外泌體主動分揀能力的I型跨膜蛋白。
 

圖1. PLXNA1的篩選與鑒定

二、NanoFCM和WB作為評估支架蛋白EV分揀能力的有效方法
為了評估PLXNA1是否滿足篩選標準的第二個要求，研究者開發了一種基于WB和納米流式的方法來評估候選支架蛋白的EV分揀能力。WB是從整體水平上對樣本蛋白進行檢測，而NanoFCM則是在單顆粒水平上檢測蛋白陽性率以及平均熒光強度(MFI)。這兩種方法的結合有助于全面評估PLXNA1的EV分揀能力。作者將GFP與支架蛋白CD63和MFGE8分別融合表達，通過ELISA和WB評估GFP蛋白分別在EV和CL中的含量以及比值。結果顯示兩種方法的結果是一致的，且GFP-CD63的富集程度略高于GFP-MFGE8(圖2b,c,d)。而與之不同的是，NanoFCM的MFI結果表明，GFP-MFGE8優于GFP-CD63(圖2e,f)，這是因為GFP MFI反映了融合蛋白的EVs中的表達，而與細胞中可能殘留的融合蛋白的數量無關。
 

圖2. PLXNA1的EV分揀能力評估

三、PLXNA1截短和融合不影響外泌體的分揀能力
按照前述的篩選標準，PLXNA1作為外泌體支架蛋白仍存在天然劣勢。首先，其N端和C端各有一個具有生物學功能的結構域；其次，該蛋白的分子量較大，約為211kDa。所以全長的PLXNA1并不適合作為外泌體支架蛋白。于是研究者對PLXNA1進行了五種不同形式的截短，并且在N端和C端與不同的貨物分子(即IL 12和GFP)進行融合改造，結果顯示該蛋白的多個截短體均保持了較高的外泌體分揀能力(圖3a,b,c)。這說明PLXNA1也同樣滿足篩選標準的第二條要求，即支架蛋白的N端以及C端進行截短或融合等改造不會顯著影響該蛋白向外泌體分揀的能力。
 

圖3. 截短的PLXNA1保持了較高的EV分揀能力

四、PLXNA1截短體作為外泌體支架蛋白的優勢
為進一步闡明PLXNA1截短體在EV分揀中的優勢，研究者將PLXNA1截短體與另外兩種廣泛認可的I型跨膜支架蛋白(Lamp2b和PTGFRN)進行了頭對頭的比較，在HEK293和MCF-7細胞系中PLXNA1截短體均展現出了明顯的載量優勢(圖4)。
 

圖4. PLXNA1截短體相較于已知支架具有優勢

研究者進一步設計實驗來驗證POI在EV表面和腔內的活性。研究者首先將PLXNA1(863-1316)和核糖體蛋白L7AE進行融合，并與目標mRNA(帶有C/D盒序列的NanoLuc mRNA)共轉染到293F細胞中，然后將產生的EV與HepG2細胞共孵育，以測試融合表達是否會影響L7AE的RNA結合能力。孵育實驗發現，NanoLuc-L7AE-EV處理的細胞中，NanoLuc mRNA水平顯著上調，且NanoLuc催化活性比用NanoLuc-EV處理的細胞高出四倍，表明L7AE工程化EVs在遞送目標mRNA方面具有優勢(圖5b)。此外，若siRNA技術干擾表達下，NanoLuc-L7AE-EV處理的細胞活性降低了30%，進一步證實了受體細胞中的NanoLuc催化活性來源于mRNA的成功遞送(圖5c)。

進一步的實驗中，研究者將NanoLuc蛋白直接融合并表達在PLXNA1(863-1316)的C端，體外實驗也表現出劑量依賴性的底物催化活性(圖5d)。同時，將小鼠IL12(mIL12)與PLXNA1的N端融合，發現重組mIL12(rmIL12)和mIL12修飾的EVs(EVmIL12)體外實驗中引發的IFN-γ激活水平相同(圖5e)。這些結果表明，無論是與支架蛋白的C端還是N端融合，對蛋白質貨物的功能影響有限。

最后，在攜帶MC38腫瘤的小鼠模型中，比較了rmIL12和EVmIL12對腫瘤生長抑制活性的影響。結果顯示，EVmIL12在相同劑量下比rmIL12表現出更有效的腫瘤生長抑制活性，并且治療效果呈劑量依賴性(圖5f,g)。這些數據綜合表明，融合到外泌體中的PLXNA1截短片段的POIs保持了甚至比重組POIs更強的活性。
 

圖5. 融合PLXNA1截短體的POIs活性評估

五、基于ALFAtag/NbALFA的通用外泌體平臺
研究者構建了一個基于ALFAtag/NbALFA系統的通用外泌體平臺(圖6a)。通過將NbALFA納米抗體融合表達在PLXNA1的N端，實現了帶有ALFAtag標簽的重組蛋白與外泌體的高效結合。這種標記方法不僅效率高(圖6b,c)，也不影響POIs的活性(圖6d)。此外，研究者還評估外泌體的保存過程中的穩定，結果表明基于NbALFA/ALFA系統的工程外泌體可以抵抗至少三次凍融，且能夠在多個條件下長時間穩定保存(圖6e,f)。由此說明，這種NbALFA/ALFA系統是一種高度通用和穩定的外泌體工程技術。
 

圖6. 基于ALFAtag/NbALFA系統的通用外泌體平臺的評估

研究意義
該項研究對外泌體支架蛋白的篩選條件進行了修訂和拓展，為外泌體遞送系統的開發帶來了更多的可能性，且篩選得到的支架蛋白PLXNA1并在對其進行截斷改造的基礎上實現了高表達、高活性、高遞送能力和高穩定性的工程化外泌體。此外，恩澤康泰構建的通用型外泌體開發平臺ALFAtag/NbALFA，為工程化外泌體后續作為藥物載體的應用潛力提供了有力證明。該研究成果標志著外泌體技術在藥物遞送和基因治療領域邁出了重要的一步，推動了工程化外泌體未來的臨床應用和產業轉化。

展望
NanoFCM不僅可對EVs的顆粒濃度、粒徑分布、載藥量、蛋白、核酸等物理生化性質進行分析，還對EVs的生產過程進行質量控制，優化生產條件、提高載藥效率。同時可對EVs在生產后的穩定性進行評價，評估不同存儲條件對EVs的影響。NanoFCM的應用貫穿整個EVs制劑研發、大規模生產、分離純化、質控、穩定性評估等整個過程，極大加速EVs產品研發和產業化進程！