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JEV文獻解讀:一種新型的工程化EVs制備技術的研發過程

瀏覽次數:1175 發布日期:2024-11-19  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)作為細胞間通訊的重要媒介,具有優異的生物相容性、低免疫原性和組織趨向性,在心血管疾病、自身免疫綜合征、神經退行性疾病和癌癥等在內的多種疾病研究中展示出應用潛力。然而,諸如缺乏低成本、自動化、大規模制備的方法等因素,嚴重限制了EVs的生物醫學應用。

近期,來自天津大學、中科院化學所和浙江腫瘤醫院的研究人員開發了一種大量制備脫水誘導細胞外囊泡(dehydration-induced extracellular vesicles, DIMVs)的新方法。該方法無需引入潛在的有毒物質,在30 min內即可大量制備DIMVs,具有快速、通用、可實現EVs規模化制備等優勢,進一步對DIMVs的免疫原性及安全性、抑制腫瘤形成和復發能力及其在藥物遞送研究中的應用潛力進行探究。該成果發表在Journal of Extracellular Vesicles上。

 

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一、DIMVs的制備與表征
作者通過脫水方式代替其他物理和化學方法以刺激細胞釋放更多的囊泡。如圖1所示,對經PBS洗滌后的細胞進行短時間脫水處理(20 min),隨后對脫水處理的細胞通過再水化過程,即分別添加PBS和培養基,在30 min內處理后細胞大量分泌微米級DIMVs,采用簡單離心即可從上清液中收獲DIMVs。作者進一步應用轉染綠色熒光蛋白的HEK293T和PC9細胞在熒光顯微鏡下監測DIMVs的形成過程,驗證了DIMVs的發芽,膨脹和脫離行為。

結合顯微成像和流式細胞術等分析方法,作者進一步確認了DIMVs是一類具有生物膜結構的微米級囊泡(2~40 mm),且在4 ℃條件下可穩定保存7天。在最佳制備條件下,每個細胞平均可產生20個DIMVs。每100萬個細胞中所得DIMVs的蛋白含量可達57 mg,是相同培養條件下所得sEVs的580倍,在蛋白質利用方面具有顯著優勢。
 

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圖1. DIMVs的制備流程示意圖


二、DIMVs與親本細胞和相同來源sEVs的組分差異
作者進一步對DIMVs、sEVs和親本細胞的組分進行分析,以表征三者在蛋白、DNA和RNA組分方面的差異(圖2)。SDS-PAGE和定量蛋白質譜結果均顯示DIMVs的蛋白質組與親本細胞更為相似;而WB結果則顯示DIMVs具有sEVs經典標志蛋白CD9、CD63和CD81的同時,也具有sEVs的陰性蛋白calnexin與GM130。這些數據表明DIMVs很可能兼具了sEVs和細胞蛋白組成的雙重特征。DNA分析結果則顯示DIMVs和sEVs中均不存在完整的基因組片段,且DIMVs中DNA含量最低,可以有效避免下游應用中cGAS-STING信號通路的激活;RNA分析結果則顯示sEVs中的RNA含量最低,且基本均為短片段,而DIMVs則顯示出最高的RNA含量,并且能夠有效地裝載長片段RNA,對于有效遞送治療性長片段RNA具有天然優勢。
 

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圖2. DIMVs、sEVs及其親本PC9細胞的組分比較


三、利用DIMVs制備類sEVs顆粒
不同大小的囊泡在體內具有不同的組織分布和代謝特征,因此調整囊泡的大小以適應各種臨床需求至關重要。在此,作者配合使用微型擠出器和微尺度過濾技術,以生產制備類sEVs顆粒。即將DIMVs連續擠壓通過1、0.4和0.1 μm的濾膜,將其制備為粒徑50~200 nm的小囊泡(圖3)。該方法所得類sEVs的產量明顯優于從細胞培養上清中所得sEVs的產量,其顆粒數量增加50倍,且該類sEVs在沒有冷凍保存劑的條件下,可穩定凍存于-80 ℃下。在細胞攝取實驗中,類sEVs和sEVs顯示出相當的溶酶體定位和細胞攝取能力,即表明這兩種類型的顆粒可能利用相同的細胞攝取途徑。
 

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圖3. 基于DIMVs的類sEVs的制備、表征及細胞攝取能力考察


四、DIMVs蛋白工程化及核酸藥物裝載
蛋白組數據顯示DIMVs可以從親本細胞中繼承絕大多數的非細胞核蛋白,因此,在DIMVs中蛋白工程化中很可能不需要通過與支架蛋白融合來產生特定蛋白的裝載。為了進一步驗證該猜想,作者分別在親本細胞的細胞膜、細胞質以及細胞內膜蛋白mScarlet-I上分別表達GFP熒光蛋白,并采用共聚焦顯微鏡和流式細胞術對所得DIMVs進行表征。流式結果顯示三種轉染細胞所得DIMVs中約40%有GFP熒光蛋白信號,且共聚焦顯微鏡揭示了DIMVs的靶蛋白繼承了其在親本細胞中的定位特征。因此,在基因工程方面,DIMVs有效地規避了當前sEVs基因修飾過程的局限性。

納米流式結果進一步發現由來源于細胞膜表達GFP親本細胞來源的DIMVs制備的類sEVs中表達目標蛋白GFP的比例為30.8%,遠高于細胞分泌的sEVs 5.13%的陽性率(圖4d)。綜合結果表明,與傳統的sEVs相比,DIMVs的蛋白貨物在基因工程化改造方面具有天然優勢。

作者進一步考察了DIMVs在核酸遞送中的能力。之前已有文章報道,可采用末端修飾膽固醇的方式將目標核酸錨定在細胞膜上,進一步實現分離囊泡內膜的核酸修飾。因此,作者評估了在膽固醇修飾與否兩種情況下DIMVs的DNA裝載能力(圖4e)。無論膽固醇修飾與否,DIMVs都能有效地裝載目標核酸分子,效率可達100%(圖4f);含有固醇的DNA分子主要集中在DIMVs的脂膜上,而不含固醇的DNA分子則集中在DIMVs內腔(圖4g);且降低培養溫度可顯著降低無膽固醇DNA在DIMVs中的富集比例和富集強度(圖4h)。且納米流式檢測技術分析結果表明固醇轉載DNA的DIMVs所得類sEVs中成功裝載目標核酸的比例可達41.3%。

綜上,無論是DIMVs或者基于DIMVs所得的類sEVs在高效裝載蛋白和核酸方面均具有巨大潛力。
 

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圖4. DIMVs作為蛋白和核酸遞送載體分析


此外,作者也通過小鼠體內實驗對DIMVs的安全性進行評估。體內成像分布顯示DIMVs在小鼠體內對腫瘤具有較好的歸巢效應,能在腫瘤部位進行有效富集;同時,作者還探討了DIMVs在B16黑色素瘤的形成和復發中的抑制效果,以及其作為腫瘤疫苗的應用潛力。

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