藥物代謝酶CYP450 IC50抑制體外評估模型解析
在臨床應用中患者經常會同時使用多種藥物，這些藥物可能會產生藥物-藥物相互作用（Drug-drug interaction, DDI），最終導致嚴重不良反應或減弱治療效果，因此，有必要對DDI發生的可能及其影響程度和嚴重性進行科學評估。對此，國家藥監局藥審中心發布的《藥物相互作用研究技術指導原則（試行）》[1]及國際人用藥品注冊技術協調理事會（ICH）發布的《M12：藥物相互作用》[2]指導原則均明確了DDI研究的目標和方向，包括代謝酶、轉運體和代謝產物三個方面。其中，代謝酶介導的藥物相互作用聚焦在底物/酶表型、抑制劑及誘導劑三個方面。本篇文章主要介紹藥物代謝細胞色素P450（Cytochrome P450, CYP酶）的可逆性IC50抑制作用評估。
一個藥物如果能抑制某代謝酶的活性，而另一同服藥物為該代謝酶的底物，則該藥可能造成同服藥物代謝清除率降低、暴露量增加，從而造成安全性隱患。以西尼地平為例，IPHASE采用肝微粒體體外溫孵技術，研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實例，結果表明環孢素、紅霉素和辛伐他丁在體外表現出對西尼地平代謝的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物，這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時可能會出現代謝上的相互作用，使西尼地平的代謝速率降低，西尼地平二氫吡啶環脫氫代謝物生成減少，而原型藥物的水平顯著提高，這可能會影響臨床療效的正常發揮。
因此，若藥物相互作用研究不充分、準確，可能會妨礙對在研藥物精準風險的評估，進而影響藥物上市及應用范圍。即開展合理、充分的藥物相互作用研究是非常必要的，其中應囊括酶抑制試驗。
可逆性酶抑制試驗研究方法介紹
據《藥物相互作用研究技術指導原則（試行）》和《M12：藥物相互作用》指出：應評估在研藥物是否會對主要的 CYP 同工酶 CYP1A2、 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A 產生可逆性抑制和時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）。
目前常見的可逆性抑制研究方法有三種。
Single-point法
粗糙的評估，適用于早期和高通量篩選，通常使用1個或2個試驗濃度（一般為1μM/ 10μM），1個探針底物濃度，以剩余活性率進行評估。結果判定一般為1μM抑制率＞50%，10μM抑制率＜50%。
IC50法
相對精準的評估，可用于進行粗略的DDI預測，通常使用4~8個試驗濃度（一般跨度2~3個log值），最高劑量為50×游離 Cmax（穩態時抑制劑藥物的最大游離血漿濃度）或0.1×劑量/250mL，1個探針底物濃度，最后以測定得到的IC50值估算Ki值。
Ki法
精準的測定手段，可用于進行DDI的更精準預測，通常使用4~5個試驗濃度（根據IC50設計濃度），4~5個探針底物濃度（0.25~10×Km），最后以測定得到的抑制常數Ki值進行評估。
鑒于此，IPHASE以肝微粒體為孵育體系，采用IC50法，將待測物的濃度設計分別為0μmol/L 、0.01μmol/L 、0.1μmol/L 、1μmol/L 、10μmol/L 和100μmol/L，通過檢測其產物生成量以評估待測物的IC50值。以下分享內容為IPHASE根據本司過往項目經驗整理總結的數據表格，旨在同大家一起學習成長。
可逆性酶抑制IC50試驗結果分析
常規數據
如上表所示，兩組數據分別是IPHASE驗證某待測物是否對某兩個亞型酶具有抑制作用。可發現第一組數據隨著待測物濃度的增加，其抑制率隨之增高，說明該待測物對某亞型酶具有抑制性；第二組數據則無明顯受濃度影響變化，則可推斷待測物對該亞型酶無抑制效果（注：IPHASE內部默認抑制率結果在±20%之內即為無抑制作用）。
異常數據：溶解度異常
在實際操作中，常會發現產物生成量的變化沒有規律性，這種情況有可能是溶解度異常導致。如上圖第一組數據所示，隨著待測物濃度的增加，抑制率先增加后不變，可能是由于待測物的溶解度較低，使得其抑制作用不會隨著濃度的增加而增大，而是逐漸趨于一致，導致出現該種現象；第二組數據則可能是待測物溶解不均勻、吸樣不均勻導致的數據異常，因此出現中間待測物濃度數據異常現象。
異常數據：酶誘導可能性
如圖所示，在研究某些待測物是否對特異性亞型酶具有抑制影響時，常可觀察到隨著待測物的加入，其代謝產物生成量反而出現了明顯增多的現象。這種現象可能是由于該待測底物是某類亞型酶的誘導劑，其在隨著待測物濃度增高或某一特定濃度下，顯示出了明顯的誘導現象，因此促進了代謝產物的生成，即酶抑制結果顯示為負值。
IPHASE產品
綜上所述，合理的IC50試驗有助于更好地判斷受試藥物和酶之間的關系。IPHASE/匯智和源作為體外生物試劑引領者，不但具有豐富的項目經驗，更為了減輕客戶試劑準備的繁復工作，以人肝微粒體為孵育體系，開發了酶抑制（IC50）研究試劑盒，縮短試劑準備時間、提供檢測效率。
IPHASE/匯智和源憑借多年的研發經驗，推出了多領域、多種類的高端科研試劑，為藥物早期研發提供篩選工具，為生命科學領域的探索提供新材料、新方法和新手段，為遺傳毒性研究提供便捷產品。此外，IPHASE/匯智和源可提供特殊產品的定制服務，望廣大科研工作者來電咨詢，咨詢熱線400-127-6686。
一個藥物如果能抑制某代謝酶的活性，而另一同服藥物為該代謝酶的底物，則該藥可能造成同服藥物代謝清除率降低、暴露量增加，從而造成安全性隱患。以西尼地平為例，IPHASE采用肝微粒體體外溫孵技術，研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實例，結果表明環孢素、紅霉素和辛伐他丁在體外表現出對西尼地平代謝的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物，這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時可能會出現代謝上的相互作用，使西尼地平的代謝速率降低，西尼地平二氫吡啶環脫氫代謝物生成減少，而原型藥物的水平顯著提高，這可能會影響臨床療效的正常發揮。
因此，若藥物相互作用研究不充分、準確，可能會妨礙對在研藥物精準風險的評估，進而影響藥物上市及應用范圍。即開展合理、充分的藥物相互作用研究是非常必要的，其中應囊括酶抑制試驗。
可逆性酶抑制試驗研究方法介紹
據《藥物相互作用研究技術指導原則（試行）》和《M12：藥物相互作用》指出：應評估在研藥物是否會對主要的 CYP 同工酶 CYP1A2、 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A 產生可逆性抑制和時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）。
目前常見的可逆性抑制研究方法有三種。
Single-point法
粗糙的評估，適用于早期和高通量篩選，通常使用1個或2個試驗濃度（一般為1μM/ 10μM），1個探針底物濃度，以剩余活性率進行評估。結果判定一般為1μM抑制率＞50%，10μM抑制率＜50%。
IC50法
相對精準的評估，可用于進行粗略的DDI預測，通常使用4~8個試驗濃度（一般跨度2~3個log值），最高劑量為50×游離 Cmax（穩態時抑制劑藥物的最大游離血漿濃度）或0.1×劑量/250mL，1個探針底物濃度，最后以測定得到的IC50值估算Ki值。
Ki法
精準的測定手段，可用于進行DDI的更精準預測，通常使用4~5個試驗濃度（根據IC50設計濃度），4~5個探針底物濃度（0.25~10×Km），最后以測定得到的抑制常數Ki值進行評估。
鑒于此，IPHASE以肝微粒體為孵育體系，采用IC50法，將待測物的濃度設計分別為0μmol/L 、0.01μmol/L 、0.1μmol/L 、1μmol/L 、10μmol/L 和100μmol/L，通過檢測其產物生成量以評估待測物的IC50值。以下分享內容為IPHASE根據本司過往項目經驗整理總結的數據表格，旨在同大家一起學習成長。
可逆性酶抑制IC50試驗結果分析
常規數據
如上表所示，兩組數據分別是IPHASE驗證某待測物是否對某兩個亞型酶具有抑制作用。可發現第一組數據隨著待測物濃度的增加，其抑制率隨之增高，說明該待測物對某亞型酶具有抑制性；第二組數據則無明顯受濃度影響變化，則可推斷待測物對該亞型酶無抑制效果（注：IPHASE內部默認抑制率結果在±20%之內即為無抑制作用）。
異常數據：溶解度異常
在實際操作中，常會發現產物生成量的變化沒有規律性，這種情況有可能是溶解度異常導致。如上圖第一組數據所示，隨著待測物濃度的增加，抑制率先增加后不變，可能是由于待測物的溶解度較低，使得其抑制作用不會隨著濃度的增加而增大，而是逐漸趨于一致，導致出現該種現象；第二組數據則可能是待測物溶解不均勻、吸樣不均勻導致的數據異常，因此出現中間待測物濃度數據異常現象。
異常數據：酶誘導可能性
如圖所示，在研究某些待測物是否對特異性亞型酶具有抑制影響時，常可觀察到隨著待測物的加入，其代謝產物生成量反而出現了明顯增多的現象。這種現象可能是由于該待測底物是某類亞型酶的誘導劑，其在隨著待測物濃度增高或某一特定濃度下，顯示出了明顯的誘導現象，因此促進了代謝產物的生成，即酶抑制結果顯示為負值。
IPHASE產品
綜上所述，合理的IC50試驗有助于更好地判斷受試藥物和酶之間的關系。IPHASE/匯智和源作為體外生物試劑引領者，不但具有豐富的項目經驗，更為了減輕客戶試劑準備的繁復工作，以人肝微粒體為孵育體系，開發了酶抑制（IC50）研究試劑盒，縮短試劑準備時間、提供檢測效率。
| 貨號 | 名稱 | 規格 |
| 0115A1.11 | IPHASE Enzyme Inhibition Research Kit(IC50),Human Liver Microsomes,Male | 0.2mL*100 test |
| 0115A1.12 | IPHASE Enzyme Inhibition Research Kit(IC50),Human Liver Microsomes,Female | 0.2mL*100 test |
| 0115A1.13 | IPHASE Enzyme Inhibition Research Kit(IC50),Human Liver Microsomes,Mixed Gender | 0.2mL*100 test |
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