3D單分子熒光成像技術在納米受體與納米顆粒表征中的應用
隨著科學研究向著更精細、更微觀的方向發展，對成像技術的要求也日益提高。傳統的光學成像技術可以提供200nm左右的分辨率，不能完全滿足細胞器，以及分子水平上的研究。法國abbelight公司基于新興單分子定位顯微成像（SMLM）技術推出了3D單分子熒光成像系統-SAFe 360，能夠提高定位精度，xyz三軸定位精度高達15 nm，支持同時四色成像，可以用于細胞納米三維成像，觀測高清晰亞細胞器結構，實時研究不同結構功能蛋白的共定位信息，以及在單分子水平研究分子動力學反應和細胞間的相互作用等。設備一經推出，已在Nature Nanotechnology、Science Advances 、BioRxiv等SCI期刊發表近40余篇文章。本文我們將概述3D單分子熒光成像系統表征納米受體和納米顆粒助力癌癥研究領域的Nature子刊文章。
一、Nature Nano:納米受體降解突變p53蛋白，助力癌癥研究
腫瘤抑制因子p53在細胞中扮演著關鍵的角色，由TP53 基因編碼，參與細胞的生長、修復及凋亡等過程的調控。超過50%的人類癌癥中存在TP53突變，乳腺癌和卵巢癌中比例更高，與野生型（WT）p53相比，錯義突變p53（mutp53）會穩定在細胞中積累到高水平，mutp53不僅失去了WTp53的功能，還獲得了致癌功能，導致增強的腫瘤發生、侵襲、轉移和對治療的抵抗。因此靶向mutp53的增強功能成為一種有效的治療策略，但是缺乏特異性自噬受體限制了這種治療策略。
華南理工大學張云嬌，楊顯珠和南方醫科大學溫龍平團隊開發了仿生納米受體（NR），使用3D單分子熒光成像系統表征相關納米受體，研究受體模擬選擇性自噬受體的功能，能夠結合mutp53蛋白，提高自噬小體的形成水平，增加對突變型 mutp53的降解效率。該研究以 “Nanoreceptors promote mutant p53 protein degradation by mimicking selective autophagy receptors”為題。發表于《Nature Nanotechnology》上。
研究者通過3D單分子熒光成像系統，通過隨機光學重構技術（STORM），提供20 nm的超高分辨率，成功表征了NR中納米顆粒NPs，MBP以及不同mutp53蛋白在NR中分布，標尺為100 nm，可視化展示了MBP介導的p53與NR表面的結合過程。可以觀察到MBP（綠色）環繞著納米粒子核心（紅色），證明了MBP成功地共軛到納米粒子表面。此外，當包括S241F、R175H、R248W、R280W和野生型p53在內的p53蛋白加入NR溶液時，各種mutp53蛋白（藍色）主要位于NR的外部表面，而野生型p53的共定位較少。
比較含有不同量DOTAP的NRs，發現增加DOTAP含量能夠提升在表達p53-S241F突變的卵巢癌細胞系ES-2中mutp53的清除效果，但是可能DOTAP的正電荷原因，隨著DOTAP的增加，NRs的毒性也隨之增加。對比后發現，20% DOTAP的NRs能夠引發足夠的自噬誘導作用，且其毒性可忽略不計，作為后續實驗的最佳配方。
免疫熒光和Western Blot證實研究證明NRs能有效降解mutp53，而mNRs、dNRs或自由MBP肽則不能，這一點通過。NRs和dNRs能增加LC3-II水平，反映出自噬的增加，而dNRs未能降解mutp533。此外，自由DOTAP或mNRs與自由DOTAP的組合也未能降解mutp53。上述結果表明，需要在同一載體上同時存在MBP和DOTAP才能降解mutp53。
為了進一步評估NRs在臨床上的潛在應用，研究者建立了p53突變（P72R+/+、C141Y+/+和L350P+/−）的患者來源的卵巢癌移植模型，小鼠在相同的13天治療方案下分別注射PBS、CDDP、NRs或NRs-Pt。NRs有效抑制了腫瘤生長，而NRs-Pt在抑制腫瘤體積和重量方面展示出進一步增強的效果。重要的是，NRs-Pt和NRs在較小程度上增強了自噬作用，在腫瘤組織中減少了mutp53并增加了細胞凋亡。
【參考文獻】
[1]. Huang, Xiaowan, et al. "Nanoreceptors promote mutant p53 protein degradation by mimicking selective autophagy receptors." Nature Nanotechnology 19.4 (2024): 545-553.
二、Nature Com：納米顆粒特異性抗體協同調控NK細胞和T細胞實現抗腫瘤免疫
NK細胞和T細胞對于先天免疫和適應性免疫系統至關重要，并在腫瘤識別和清除中發揮互補且協調的作用。近期研究表明，靶向在NK細胞和T細胞上共表達的檢查點分子，如TIGIT和NKG2A可以引發同步的先天和適應性免疫。然而，使用相應的單克隆抗體（mAbs）進行的單一療法在臨床試驗中未能達到預期效果，這歸因于腫瘤發病機制的復雜性，突顯了將mAbs與其他檢查點抑制劑結合的必要性。
近日，華南理工大學沈松，王均團隊開發了一種三特異性納米抗體（Tri-NAb），并且使用3D單分子熒光成像系統表征這些納米顆粒以及對應抗體的位置，研究Tri-NAb通過協調NK細胞和T細胞在體外和體內顯示出顯著的抗腫瘤效果，體現了其協同NK細胞和T細胞的轉化潛力。 該成果以“Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity”為題，發表于《Nature Communications》上。
研究者首先通過多變量篩選設計了一種具有最佳配方的生物相容性白蛋白/聚酯復合納米顆粒（APCN），再將αPDL1/α4-1BB/αNKG2A固定在預先組裝了αFc的APCN上得到Tri-Nab，Tri-Nab積聚在腫瘤中，有效觸發NK細胞和CD8+ T細胞的激活（①）和增殖（②），增強它們與腫瘤細胞的相互作用（③），從而刺激細胞毒性顆粒的釋放（④）。這種協調的相互作用引發了高效的腫瘤細胞凋亡（⑤）。
為了確認Tri-Nab的合成，研究者利用ELISA、電鏡和3D單分子熒光成像系統進行表征，其中3D單分子熒光成像系統表征了納米顆粒。熒光光譜顯示，加入聚L-丙交酯PLLA后，HSA的內在熒光信號顯著減弱，表明PLLA可能改變了圍繞發光分子的疏水環境，用羅丹明B（PLLA）和iFluor™ 488（HSA）標記后，超分辨圖像顯示了PLLA和HSA在APCNs內準確的共定位的情況。
為驗證治療性抗體與相應抗原結合的能力，ELISA和流式分別證明了Tri-NAb的親和力和游離的αPDL1、α4-1BB和αNKG2A無異，而且Tri-Nab可以粘附在PDL1，4-1BB和NKG2A表達的細胞上，且Tri-Nab單克隆抗體靶向結合的可能性很高。細胞實驗中進一步發現NPαPDL1+α4-1BB和Tri-NAb處理組中CD8+ T細胞（綠色）與MC38腫瘤細胞（紅色）之間的相互作用增強，而NPαPDL1+αNKG2A和Tri-NAb有效促進了NK細胞（藍色）與腫瘤細胞的相互作用。
為了驗證Tri-Nab在體內的效果，研究者在小鼠黑色素瘤模型中評估了Tri-NAb的治療效果。與IgG對照組和Tri-mAbs相比，治療NPαPDL1+α4-1BB、NPαPDL1+αNKG2A或NPα4-1BB+αNKG2A顯示出在腫瘤控制方面的一些優勢，而Tri-NAb表現出對腫瘤進展的更強抑制作用（圖b、c）。在給藥三次后，流式結果展示了腫瘤組織中的免疫細胞浸潤情況。Tri-NAb處理組中的NK細胞和CD8+ T細胞的百分比和數量明顯高于其他治療組（圖d–i），這表明Tri-NAb有效激活了NK細胞和CD8+ T細胞，從而增強了抗腫瘤活性。此外，小鼠的生存時間顯著延長，9只小鼠中有2只實現了完全腫瘤消退（圖j），而在治療期間未觀察到小鼠體重或外周血炎癥細胞因子水平的顯著變化。
綜上所述，本研究證明了同時靶向NK細胞和CD8+ T細胞的三特異性納米抗體的可行性和有效性，具有巨大的臨床應用潛力。
【參考文獻】
[1]. Ye, Qian-Ni, et al. "Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity." Nature Communications 15.1 (2024): 6211.
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華南理工大學張云嬌，楊顯珠和南方醫科大學溫龍平團隊開發了仿生納米受體（NR），使用3D單分子熒光成像系統表征相關納米受體，研究受體模擬選擇性自噬受體的功能，能夠結合mutp53蛋白，提高自噬小體的形成水平，增加對突變型 mutp53的降解效率。該研究以 “Nanoreceptors promote mutant p53 protein degradation by mimicking selective autophagy receptors”為題。發表于《Nature Nanotechnology》上。
研究者通過3D單分子熒光成像系統，通過隨機光學重構技術（STORM），提供20 nm的超高分辨率，成功表征了NR中納米顆粒NPs，MBP以及不同mutp53蛋白在NR中分布，標尺為100 nm，可視化展示了MBP介導的p53與NR表面的結合過程。可以觀察到MBP（綠色）環繞著納米粒子核心（紅色），證明了MBP成功地共軛到納米粒子表面。此外，當包括S241F、R175H、R248W、R280W和野生型p53在內的p53蛋白加入NR溶液時，各種mutp53蛋白（藍色）主要位于NR的外部表面，而野生型p53的共定位較少。
比較含有不同量DOTAP的NRs，發現增加DOTAP含量能夠提升在表達p53-S241F突變的卵巢癌細胞系ES-2中mutp53的清除效果，但是可能DOTAP的正電荷原因，隨著DOTAP的增加，NRs的毒性也隨之增加。對比后發現，20% DOTAP的NRs能夠引發足夠的自噬誘導作用，且其毒性可忽略不計，作為后續實驗的最佳配方。
免疫熒光和Western Blot證實研究證明NRs能有效降解mutp53，而mNRs、dNRs或自由MBP肽則不能，這一點通過。NRs和dNRs能增加LC3-II水平，反映出自噬的增加，而dNRs未能降解mutp533。此外，自由DOTAP或mNRs與自由DOTAP的組合也未能降解mutp53。上述結果表明，需要在同一載體上同時存在MBP和DOTAP才能降解mutp53。
為了進一步評估NRs在臨床上的潛在應用，研究者建立了p53突變（P72R+/+、C141Y+/+和L350P+/−）的患者來源的卵巢癌移植模型，小鼠在相同的13天治療方案下分別注射PBS、CDDP、NRs或NRs-Pt。NRs有效抑制了腫瘤生長，而NRs-Pt在抑制腫瘤體積和重量方面展示出進一步增強的效果。重要的是，NRs-Pt和NRs在較小程度上增強了自噬作用，在腫瘤組織中減少了mutp53并增加了細胞凋亡。
【參考文獻】
[1]. Huang, Xiaowan, et al. "Nanoreceptors promote mutant p53 protein degradation by mimicking selective autophagy receptors." Nature Nanotechnology 19.4 (2024): 545-553.
二、Nature Com：納米顆粒特異性抗體協同調控NK細胞和T細胞實現抗腫瘤免疫
NK細胞和T細胞對于先天免疫和適應性免疫系統至關重要，并在腫瘤識別和清除中發揮互補且協調的作用。近期研究表明，靶向在NK細胞和T細胞上共表達的檢查點分子，如TIGIT和NKG2A可以引發同步的先天和適應性免疫。然而，使用相應的單克隆抗體（mAbs）進行的單一療法在臨床試驗中未能達到預期效果，這歸因于腫瘤發病機制的復雜性，突顯了將mAbs與其他檢查點抑制劑結合的必要性。
近日，華南理工大學沈松，王均團隊開發了一種三特異性納米抗體（Tri-NAb），并且使用3D單分子熒光成像系統表征這些納米顆粒以及對應抗體的位置，研究Tri-NAb通過協調NK細胞和T細胞在體外和體內顯示出顯著的抗腫瘤效果，體現了其協同NK細胞和T細胞的轉化潛力。 該成果以“Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity”為題，發表于《Nature Communications》上。
研究者首先通過多變量篩選設計了一種具有最佳配方的生物相容性白蛋白/聚酯復合納米顆粒（APCN），再將αPDL1/α4-1BB/αNKG2A固定在預先組裝了αFc的APCN上得到Tri-Nab，Tri-Nab積聚在腫瘤中，有效觸發NK細胞和CD8+ T細胞的激活（①）和增殖（②），增強它們與腫瘤細胞的相互作用（③），從而刺激細胞毒性顆粒的釋放（④）。這種協調的相互作用引發了高效的腫瘤細胞凋亡（⑤）。
為了確認Tri-Nab的合成，研究者利用ELISA、電鏡和3D單分子熒光成像系統進行表征，其中3D單分子熒光成像系統表征了納米顆粒。熒光光譜顯示，加入聚L-丙交酯PLLA后，HSA的內在熒光信號顯著減弱，表明PLLA可能改變了圍繞發光分子的疏水環境，用羅丹明B（PLLA）和iFluor™ 488（HSA）標記后，超分辨圖像顯示了PLLA和HSA在APCNs內準確的共定位的情況。
為驗證治療性抗體與相應抗原結合的能力，ELISA和流式分別證明了Tri-NAb的親和力和游離的αPDL1、α4-1BB和αNKG2A無異，而且Tri-Nab可以粘附在PDL1，4-1BB和NKG2A表達的細胞上，且Tri-Nab單克隆抗體靶向結合的可能性很高。細胞實驗中進一步發現NPαPDL1+α4-1BB和Tri-NAb處理組中CD8+ T細胞（綠色）與MC38腫瘤細胞（紅色）之間的相互作用增強，而NPαPDL1+αNKG2A和Tri-NAb有效促進了NK細胞（藍色）與腫瘤細胞的相互作用。
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綜上所述，本研究證明了同時靶向NK細胞和CD8+ T細胞的三特異性納米抗體的可行性和有效性，具有巨大的臨床應用潛力。
【參考文獻】
[1]. Ye, Qian-Ni, et al. "Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity." Nature Communications 15.1 (2024): 6211.
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