兩種或多種蛋白質之間的相互作⽤促進多種生物功能的發揮，構成生理過程的基礎。探究蛋⽩質的相互作⽤對于了解健康和疾病的生理過程至關重要。因此，蛋白質科學和相互作用方法可被視為生物和醫學研究中最廣泛的應用之一，并構成了藥理學理論的基礎之一。酶標儀的運用使全面記錄蛋白質結合事件成為可能。

尋找研究蛋白質互作的最佳方法

近年來，酶標儀的使用徹底改變了蛋白質相互作用研究領域，這主要歸功于檢測方法眾多。找到合適方法對于確保高數據質量和精確結果至關重要。雖然在利用酶標儀研究蛋白質相互作用的應用中，一些基于吸光度的方法（如夾心ELISA）仍在使用，但基于熒光或化學發光的方法如今更為常見，這是因為熒光或化學發光法具有靈敏度高、高通量兼容性強等優點。在這方面，通常采用基于福斯特共振能量轉移（FRET）和生物發光共振能量轉移（BRET）的檢測方法。BRET和FRET都是基于兩個信號分子之間的能量轉移。通過將兩個信號分子連接到兩個相關蛋白質上，利用這種信號轉移來檢測二者之間的相互作用。兩種蛋白質之間的結合使附著的信號分子在空間上相互靠近，從而實現能量轉移（圖1）。

圖1：使用CFP和YFP進行 FRET檢測的示例。A) CFP 和 YFP 的光譜：CFP（供體）發射光譜與YFP（受體）激發光譜發生重疊（光譜重疊）。B) FRET示意圖：在兩種蛋白質沒有相互作用的情況下，CFP被激發并發出特定波長的光。C) 當兩者發生相互作用，FRET發生，YFP發出另一種波長的光，而CFP的發光強度會被淬滅。

基于BRET和FRET原理開發的先進應用可進一步提高蛋白質相互作用測量的靈敏度和讀出質量。比如在基于NanoBRET技術的應用中，使用從深海蝦中提取的 NanoLuc® 熒光素酶作為信號分子，與傳統的熒光素酶相比，信號輸出量大大增加。

下面的例子基于NanoBRET方法，能夠檢測蛋白質的泛素化過程。泛素標記需要被細胞內的酶降解的蛋白質，這一過程由蛋白質靶向嵌合體（PROTACs）促進。PROTACs的這一特性為靶向降解與疾病有關的蛋白質提供了特殊的治療潛力。我們通過動力學實驗研究蛋白質BRD4的泛素化。為此，利用CRISPR/Cas-9基因組編輯技術用HiBiT（NanoLuc熒光素酶的一個亞基）標記BRD4。并且用NanoBRET受體 HaloTag® 標記單個泛素分子。通過PROTAC ARV-771對BRD4進行泛素化，使 NanoLuc熒光素酶靠近被標記的泛素分子，從而使 BRET 信號以濃度依賴的方式隨著泛素化的進行而增加（圖2）。

圖2：監測蛋白質BRD4泛素化的NanoBRET試驗。在泛素化過程中，隨著泛素與BRD4在空間上的接近，與BRD4相耦合的NanoLuc熒光素酶和與泛素分子相耦合的HaloTag之間基于BRET的能量轉移增加。

這一應用實例證明，在檢測極低濃度的PROTAC時，基于NanoBRET的方法靈敏度較高。

TR-FRET是將時間分辨測量與FRET原理相結合，使用的信號分子隨著時間的推移具有很高的信號穩定性。這樣就可以利用時間窗口來測量蛋白質之間的相互作用，在相互作用信號仍可被檢測到的同時，來自檢測背景的信號已大部分消退，從而大大提高了靈敏度。基于TR-FRET的檢測通常用于研究受體與其配體的相互作用。

酶標儀在蛋白質互作研究中發揮的作用

由于上述蛋白質相互作用測定通常是在高通量條件下進行的，因此將臺式測定轉換為自動化高通量篩選（HTS）測定會受到一些特定的限制。其中的重要因素是酶標儀的靈敏度和速度，以及自動化兼容性。通過分析相互作用測量的結合曲線，可以深入了解蛋白質互作的結合動力學、解離常數和化學計量學。包括所有BMG LABTECH設備在內的先進酶標儀還可提供動力學測量，支持結合曲線的測量。

圖3：BMG LABTECH的PHERAstar® FSX是一款HTS專用多功能酶標儀。配備專用功能，是研究蛋白質相互作用的利器。

HTS專用多功能酶標儀（如BMG LABTECH的PHERAstar® FSX）是解決這些問題的理想檢測平臺。由于可提供所有常用的檢測模式，并能滿足篩選所需的性能，為檢測選擇提供了充分的靈活性。除此之外，PHERAstar® FSX酶標儀還可配備專用功能，用于更詳細、更靈敏地分析蛋白質相互作用。板載試劑移液器、同時檢測兩個發射信號（SDE）和超高速采樣等功能可實現高通量實時動力學相互作用分析。與各種機械臂平臺和軟件接口的兼容性還可使檢測實現完全自動化。

歡迎關注進科馳安官方微信（微信公眾號：Bio-Gene）
回復：BMG，查看更多相關視頻
長按/掃描以下二維碼可識別關注公眾號

廣州進科馳安科技有限公司
Bio-Gene Technology Ltd.
熱線：176 2009 3784
www.bio-gene.com.cn
marketing@bio-gene.com.cn
香港 北京 上海 廣州 濟南