神經元使用不同的蛋白質組合建立突觸接觸，從而定義突觸的特異性、功能和可塑性潛力，為學習和記憶的形成提供了分子基礎。越來越多的證據顯示，突觸在結構和功能上有很大的多樣性。然而，突觸蛋白質組的多樣性在很大程度上仍未可知。

近日，德國馬克斯-普朗克研究所在Cell上發表了題為The proteomic landscape of synaptic diversity across brain regions and cell types的文章。作者從7個轉基因小鼠系、5個不同腦區中分離出18種不同突觸類型的蛋白質組，發現了1800種獨特的突觸類型豐富的蛋白質。作者鑒定了共享的突觸蛋白模塊及蛋白質組學熱點，并提供了突觸蛋白質組學與細胞或電路水平結合的研究框架。
 

1 蛋白質組量化的流程開發
作者使用熒光激活的突觸體分選（FASS）制備純化突觸體，并耦合質譜儀進行定量 (圖1A),開發了一套簡化的工作流程，用于量化不同腦區、不同細胞類型突觸的蛋白質組區域。將Gad2-cre（皮層抑制性）及Camk2acre（皮層興奮性）品系與SypTOM品系雜交（圖1A），主成分分析(PCA)顯示與未分選的突觸體的具有顯著差異(圖1C、1D、S1H和S1I)。定量顯示，其富集程度最高的蛋白質幾乎完全代表著現有的皮層興奮性/抑制性突觸標記蛋白(圖1D和1E)。Camk2a::SypTOM中富集程度最高的20個蛋白中，有19個已在SynGO數據庫有注釋。證明此工作流程可從少量純化的突觸體中識別突觸蛋白。
 

圖1. 突觸多樣性、蛋白質組學的檢測流程及驗證實驗(A)蛋白組量化的工作流程圖(B) FASS等高線圖。(C) Camk2a+與Gad2+突觸體蛋白組的PCA分析。(D) Camk2a+及Gad2+突觸體與對照突觸體前體的蛋白富集差異散點圖。(E) Camk2a+ (石灰綠色)與Gad2+突觸體(玫瑰色)顯著富集蛋白比對的火山圖

2 流程應用及數據查詢工具
作者隨后將上述流程應用于來自5個不同腦區、4種Cre小鼠模型的15種不同主要突觸亞型的蛋白質組學多樣性研究。結果顯示，不同腦區Camk2a::SypTOM及Gad2::SypTOM突觸體的特異性有差別。但在突觸體豐度、突觸囊泡的大小或存在、突觸線粒體或腦區之間的突觸后結構方面無差異。PCA分析顯示，與腦區相比，細胞類型對突觸蛋白質組的影響更大。

作者共鑒定了15個突觸蛋白質組超10,000種蛋白組，其中80%為syngo已注釋蛋白，富集蛋白組>1,800種，并創建了一個交互式網絡工具 (The Synaptic Diversity Hub, https://syndive.org/)，可供查詢探索 。

3 胞吞/胞吐作用蛋白的富集特性
在幾乎所有突觸類型中，突觸囊泡泡atp酶(vATPases)以及介導突觸囊泡內吞作用的蛋白質顯著富集(定義為共享蛋白)。在所有腦區，Gad2:: sytom與Camk2a:: sytom富集蛋白很少重疊(約1%)。

某些蛋白家族如Rab、Vamp、Stx或Syt家族成員在興奮性（Camk2a）或抑制性（Gad2）突觸上表現出不同的富集特征。隨后對這些蛋白質的一個子集進行免疫印跡實驗，采用Sapphire激光掃描成像系統進行拍攝（Azure Biosystems）。結果顯示，Vamp1, complexin-1/2, Syt2在Camk2a中相較于Gad2顯著富集，而Syt12, Stx1a則在Gad2中更顯著富集，證實了這些數據(圖S4C-S4E)。免疫印跡和質譜分析之間有很好的相關性(Pearson’s r=0.95)。這種多樣性表明，這些蛋白質可能以不同的方式調節相同的突觸分子過程。
 

圖S4.突觸蛋白的共享和亞型特異性富集(C)免疫印跡驗證（Sapphire 激光掃描成像系統拍攝）。(D)免疫印跡定量直方圖。(E)免疫印跡與質譜分析相關圖。

而在CX和HC中，>95%的CAMs（細胞粘附分子）僅富集于興奮性或抑制性突觸蛋白質組，具有高度的細胞類型特異性。綜上，內吞作用和vATPases使用通用的突觸蛋白模塊，不因神經遞質類型而異；而胞吐機制、突觸前活躍區等則使用類型特異的蛋白質組。

4 VGlut1及vGat相關蛋白組研究
作者將所有蛋白質模塊與突觸亞型的特征相關聯，揭示了具有兩個不同對立簇的蛋白-蛋白相關網絡，分別具有與VGlut1或vGat高度相關或負相關的特征，代表不同細胞類型和大腦區域中與興奮性或抑制性神經遞質相關的蛋白質組。作者鑒定出188個和315個與VGlut1或vGat表達顯著相關的蛋白，找到位于群落連接節點的核心蛋白(圖4D) ，以及可能區分特定突觸亞型的中度相關蛋白。另外發現130種與vGat表達以及158種與VGlut1表達顯著相關的新突觸蛋白。

基因集富集分析(GSEA)表明，vGat和VGlut1蛋白群落具有特異的富集途徑或生物功能：VGlut1群落中突觸后信號通路和樹突棘相關蛋白顯著富集(圖4F) 。vGat群落中，GABA受體復合物的蛋白顯著富集。鑒定出皮層和海馬體中的22對蛋白質對，在興奮性和抑制性突觸中的富集呈顯著負相關 (圖4G, 4H) 。并發現一些新蛋白，可能在相同的突觸分子過程中，參與調節突觸的類型特異性。
 

圖4.突觸蛋白-蛋白相關網絡(D)蛋白質節點與vGat免疫反應(上)及VGlut1免疫反應(下)的相關性(E) 與vGat免疫熒光顯著相關模塊中的蛋白質。(F) VGlut1和vGat蛋白群落富集通路的脊圖。(G)皮層和海馬Camk2a+和Gad2+突觸蛋白質組中負相關蛋白對的熱圖。(H)負相關蛋白對的相關圖。

5 帕金森及罕見突觸類型的研究應用
為研究特異性與共享多巴胺能突觸蛋白（其退化與帕金森密切相關），作者鑒定了在紋狀體中，多巴胺能突觸相比于其他14種突觸類型的突觸蛋白富集情況。顯示多巴胺能突觸中缺乏Oxr1可能導致氧化損傷的易感性(例如，在帕金森病期間)。而蛋白激酶Erk1 (Mapk3)通過在多巴胺能突觸的特異性富集與帕金森病相關。相對于紋狀體Syn1:: sytom突觸，Dat:: sytom突觸蛋白質組富集了參與多巴胺生物合成、運輸和降解的關鍵蛋白。免疫印跡實驗（Sapphire激光掃描成像系統拍攝）驗證了這些發現 (圖S6B)。此外，共享富集的蛋白包括vATPases、蛋白酶體亞基和內吞蛋白(圖5F和S6C)。
 

圖S6.多巴胺能蛋白組分析(B)驗證Oxr1、Mapk3和Atp6v1g1在Dat+及Syn1+突觸的富集或去富集。(C)突觸前末端的Dat+和Syn1+突觸中富集的選定蛋白。(D)突觸體制備的不同組分的SDS-PAGE和免疫印跡。(E)原代大鼠皮質神經元PSME1免疫共沉淀實驗的免疫印跡。(F)小鼠紋狀體F2/3組分和純化的20Si蛋白酶體的SDS-PAGE。圖B、D、E、F均為Sapphire拍攝。

此技術流程同樣可用于研究小分支或罕見細胞的突觸類型。例如，作者成功的量化了Gad2:: sytom的抑制性突觸蛋白質組。又在對皮質GABA能神經元亞類的研究中，分選得到的VIP+、PV+和SST+突觸體（分別僅占所有顆粒的0.5%、3%、5%）的純度均＞80%，且成功檢測出其蛋白的富集。進一步分析顯示，細胞類型的發育起源對皮質抑制性突觸蛋白質組的影響不大。最后，作者發現了共600種與這三種抑制性突觸類型的功能差異相關的蛋白質。

6 總結
本研究開發了一套突觸蛋白組的分子系統生物學分析框架。預計類似的實驗策略可用于突觸的多組學分析，研究其他生物分子(如聚糖、脂質或RNA)的突觸多樣性。未來，突觸蛋白組也可與局部轉錄組整合描述RNA定位和局部翻譯在突觸蛋白質組多樣性中的作用。此外，Cre/ lox系統等方法也將啟發在細胞水平的研究。

關注我們，解鎖更多Western Blot新技能，放飛科研無限想象！

Azure Biosystems
Azure Biosystems成立于2013年，總部位于美國加州灣區，是一家致力于生命科學領域先進生物成像系統研發、制造、推廣及服務一體的創新型公司。擁有分子成像領域30余年經驗的卓越團隊，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系統和Sapphire激光掃描成像系統已成為技術領先的特色產品。目前，公司已形成分子凝膠成像、Western Blot、RT-PCR及配套試劑耗材等產品線。

公司成像設備全球裝機＞5000臺，用戶數量＞30000，包括美國最高科研機構NIH、梅約診所、哈佛大學、中國科學院、清華大學、諾華制藥等知名科研院所、醫院及生物醫藥企業等。截至目前，已發表大量文章，發表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等國際著名期刊雜志。