卵巢癌（Ovarian cancer，OC）是影響女性生殖系統的三種常見惡性腫瘤之一。轉錄因子Forkhead box蛋白O1（FoxO1），又稱forkhead橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma）轉錄因子，屬于Forkhead box O（FoxO）轉錄因子家族，處于腫瘤分子調控網絡的中心。大量研究表明，FoxO1失衡與腫瘤發展、侵襲和轉移的病理過程密切相關。然而，關于FoxO1在OC中的作用沒有統一的結論。

2024年2月25日，醫藥生物技術國家重點實驗室（南京大學）竇環博士團隊以“FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6A modification of SMC4”為題在《Cancer Science》雜志發表研究論文，討論了FoxO1在OC中的作用和分子機制，表明了FoxO1驅動的4號染色體結構維持（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）表達對OC發生至關重要，本研究可能為OC患者的早期診斷和靶向治療提供重要啟示。


標題：FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6A modification of SMC4（FoxO1增加SMC4轉錄和METTL14介導m6A修飾以促進卵巢癌發展）
時間：2024-2-25
期刊：Cancer Science
影響因子：IF 5.7
技術平臺：ChIP-seq等
 
研究摘要
轉錄因子FoxO1與卵巢癌（OC）發生發展密切相關，但其作用和分子機制尚不清楚。本研究分析結果解釋了FoxO1在OC患者的臨床樣本中高表達，且與預后不良顯著相關。FoxO1敲低在體外和體內抑制OC細胞增殖。ChIP-seq結合GEPIA2和Kaplan-Meier數據庫分析表明，4號染色體的結構維持（SMC4）是FoxO1的下游靶標，FoxO1通過與其-1400/-1390 bp啟動子結合來促進SMC4轉錄。SMC4高表達顯著阻斷了FoxO1敲低的腫瘤抑制作用。此外，FoxO1通過轉錄激活甲基轉移酶樣14（METTL14）并增加其編碼序列區域上的SMC4 m6A甲基化來增加SMC4 mRNA豐度。癌癥基因組圖譜（TCGA）數據集分析證實了OC中FoxO1、SMC4和METTL14表達之間存在顯著正相關。總之，這項研究揭示了FoxO1調控SMC4的分子機制，并在OC發生過程中FoxO1/METTL14/SMC4的表達之間建立了臨床聯系，從而提供了潛在的診斷靶點和治療策略。
  （1）卵巢癌（OC）中FoxO1過表達與預后不良相關。
圖1：FoxO1在OC組織中上調，FoxO1的高表達與預后不良有關。
（A）FoxO1基因在GSE18520的OC和正常卵巢組織中的表達水平。
（B）IHC檢測到34例OC組織和鄰近正常對照組織中FoxO1表達的代表性圖像。
（C-D）  FoxO1染色強度（C）和定量分析（D）的代表性圖像。
（E）使用Kaplan–Meier數據庫分析了TCGA和GEO數據集中OC患者的OS和PFS。

表1：OC患者FOXO1蛋白水平與臨床病理特征的關系。

（2）FoxO1在體外促進OC細胞增殖、遷移和侵襲 （A-B）  用FoxO1過表達質粒或空載體轉染的OC細胞系中FoxO1 mRNA和蛋白質表達的比較。
（C）    使用CCK-8法分析細胞活力。
（D）    通過菌落形成實驗確定的菌落的代表性圖像。
（E–H）  通過流式細胞術檢測EdU（E）、細胞周期（F）和凋亡（H）檢測到的細胞增殖；（G）western blot檢測G1/S期標記蛋白。
（I）     劃痕愈合實驗檢測細胞遷移。比例尺=400μm。
（J-K）   通過transwell檢測細胞遷移（J）和侵襲（K）能力。比例尺=200μm。
  圖3：FoxO1沉默在體外抑制OC細胞的增殖、遷移和侵襲并促進其凋亡。
（A-B）  用siFoxO1或siNC轉染的OC細胞系中FoxO1 mRNA和蛋白質表達的比較。
（C）    使用CCK-8測定法分析細胞活力。
（D）    通過菌落形成實驗確定的菌落的代表性圖像。
（E–H）  通過流式細胞術測定EdU（E）、細胞周期（F）和凋亡（H）檢測到的細胞增殖；（G）western blot檢測G1/S期標記蛋白。
（I）     劃痕愈合實驗檢測細胞遷移。比例尺=400μm。
（J-K）   通過transwell檢測細胞遷移（J）和侵襲（K）能力。比例尺=200μm。
 
（3）敲低FoxO1抑制體內OC腫瘤發生 圖4：FoxO1的敲低抑制了C57BL/6小鼠中ID8衍生的原位異種移植物的生長。將穩定轉染shNC或靶向FoxO1的shRNA的ID8細胞皮下注射到C57BL/6小鼠的背側（n=6）。
（A-B）  通過RT-qPCR和western blot驗證慢病毒產生穩定FoxO1敲低細胞系。
（C-E）  （C）腫瘤結節、（D）腫瘤重量和（E）小鼠異種移植物腫瘤體積的生長曲線。
（F）    小動物的活體成像檢測異種移植腫瘤的熒光強度。
（G）    IHC檢測shNC和shFoxO1腫瘤組織中Ki-67的表達。

4、SMC4受FoxO1轉錄調控
圖5：FoxO1直接激活OC中的SMC4轉錄。
（A）   OC中FoxO1下游靶標的篩選策略圖。
（B）   使用GEPIA2數據庫分析了OC和正常卵巢組織樣品之間DEG的火山圖。
（C）   DEG的GO富集分析（列出了前20位）。
（D）    ChIP-seq分析ID8細胞中FoxO1結合序列在DNA長度上的分布。
（E）    FoxO1結合啟動子區域中基因的維恩圖以及細胞遷移、增殖和周期的DEG。
（F）    RT-qPCR檢測FoxO1的36個潛在結合靶標的表達，并穩定敲低FoxO1及其對照細胞。
（G-H）  在FoxO1的高表達或敲低后檢測到SMC4的mRNA和蛋白質水平。
（I）     FoxO1與SMC4啟動子序列結合的IGV圖。
（J）     JASPAR數據庫預測了SMC4啟動子區域中潛在的FoxO1結合位點和motif。
（K）     ChIP-qPCR驗證SMC4啟動子處FoxO1的富集水平。
（L）     SMC4啟動子熒光素酶報告基因示意圖。
（M）    轉染FoxO1過表達或對照質粒后，檢測到SMC4-WT、SMC4-MUT或SMC4-TRU結合位點的熒光素酶活性。
（N）    轉染FoxO1過表達或穩定敲低FoxO1及其對照ID8細胞的對照質粒后，檢測到具有WT結合位點的熒光素酶活性。

（5）SMC4介導FoxO1加重體內OC惡性表型 (A-B)   在GEO數據集中比較OC組織與正常上皮組織中SMC4的表達水平。
(C-D)   使用Kaplan–Meier數據庫分析TCGA和GSE9891數據集中OC患者的總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）。
(E-F)   檢測轉染SMC4高表達質粒或siSMC4后的SMC4 mRNA和蛋白水平。
(G)    使用CCK-8實驗分析細胞活力。
(H)    通過集落形成實驗確定的代表性圖像。
(I–L)   通過流式細胞儀檢測EdU標記的細胞增殖（I）、細胞周期（J）和凋亡（L）；
(K)    通過western blot檢測G1/S期標記蛋白。
(M)    使用劃痕愈合實驗檢測細胞遷移。比例尺= 400μm。
(N)    通過Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。比例尺= 200μm。
(O)    通過western blot檢測TGF-β/Smad和JAK2/STAT3通路分子的蛋白表達變化。將穩定轉染了shNC或針對FoxO1的shRNA的ID8細胞皮下注射到C57BL/6小鼠的背部側翼（n = 6），并在腫瘤內注射高表達SMC4的慢病毒或對照病毒。
(P)    在腫瘤中檢測SMC4的蛋白表達水平。
(Q-S)  小鼠異種移植物的腫瘤結節(Q)、腫瘤重量(R)以及腫瘤體積(S)生長曲線。

(6) FoxO1通過METTL14介導的m6A修飾促進SMC4 mRNA的穩定性
圖 7：FoxO1通過調調控METTL14介導的m6A修飾來促進SMC4表達。
(A)    在用放線菌素D（5微克/毫升）處理0、3或6小時后，使用RT-qPCR分析FoxO1低表達對ID8細胞中SMC4 mRNA半衰期的影響。
(B)    在FoxO1高表達后，檢測m6A修飾關鍵調控基因的mRNA水平。
(C)    在FoxO1高表達后，檢測m6A修飾關鍵調控基因的蛋白水平。
(D)    使用Kaplan–Meier數據庫分析GSE30161數據集中OC患者的總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）。
(E-F)   在轉染高表達METTL14質粒或siMETTL14后，檢測METTL14和SMC4的mRNA和蛋白水平變化。
(G)    使用Western blot檢測在敲低FoxO1后高表達METTL14對METTL14和SMC4蛋白水平的影響。
(H)    使用METTL14-RIP-qPCR檢測FoxO1敲低后SMC4 mRNA的富集情況。
(I)     SRAMP數據庫中SMC4 mRNA的預測結果顯示m6A修飾的潛在位點。紅色箭頭指向高置信度位點。
(J)     使用MeRIP-qPCR檢測在METTL14低表達后SMC4 mRNA預測結合位點的富集情況。
(K)    使用RT-qPCR分析METTL14高或低表達對SMC4 mRNA半衰期的影響。
(L)     在ID8細胞中轉染含有RNA甲基化編輯器和gRNA或非靶向gRNA（NT-gRNA）的慢病毒后，通過RT-qPCR檢測SMC4 mRNA的半衰期。
(M)    在ID8細胞中轉染含有RNA甲基化編輯器和gRNA或NT-gRNA的慢病毒后，檢測SMC4 mRNA和蛋白的表達。
(N)    在ID8中敲低FoxO1后，使用MeRIP-qPCR檢測SMC4 mRNA預測結合位點的富集情況。
(O)    使用ChIP-qPCR鑒定FoxO1在METTL14啟動子的富集水平。
(P)    在轉染FoxO1過表達或對照質粒后，檢測METTL14-WT、METTL14-MUT結合位點的熒光素酶活性。
 
（7）OC中FoxO1、SMC4和METTL14的表達呈正相關 圖8：在臨床樣本和小鼠模型中，FoxO1、SMC4和METTL14在卵巢癌（OC）中的相關性分析。
(A)    散點圖顯示了來自TCGA的376名OC患者OC組織中FoxO1、SMC4和METTL14 mRNA的相關性。
(B)    使用斯皮爾曼相關性分析檢測了12只小鼠異種移植物中FoxO1、SMC4和METTL14 mRNA水平之間的相關性。
(C)    工作模型展示了通過轉錄激活和增加METTL14介導的m6A修飾來調控SMC4，從而促進OC的發展。

研究小結：
本研究揭示了FoxO1在卵巢癌（OC）中的致癌作用，以及FoxO1在SMC4的轉錄激活和METTL4介導的m6A修飾機制。FoxO1可以直接與SMC4啟動子結合，以促進SMC4的翻譯，此外，FoxO1還可以直接與METTL14啟動子結合，并通過m6A METTL14依賴性方式促進SMC4的穩定性，從而促進OC細胞的增殖、遷移和侵襲（圖8C）。這些發現表明，FoxO1/METTL14/SMC4軸是診斷和治療OC的一個有前景的因素。
 
參考文獻：
Tan L, Wang S, Huang S, Tie Y, Sai N, Mao Y, Zhao S, Hou Y, Dou H. FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6 A modification of SMC4. Cancer Sci. 2024 Feb 25. doi: 10.1111/cas.16120. PubMed PMID: 38403332.