端粒酶催化亞基TERT表達量檢測試劑盒 (QPCR方法說 明書)
【產品規格】
BPT5 0 50T (50人份 ，其 中4個組分按5個10人份獨立包裝 ，Biowing® Specific Reverse Transcription Primer按20ul*2獨立包裝 。)
【產品說明】
端 粒酶(Telomerase ) 是一種酶促核糖核蛋 白復合物 。其催化亞基 (TERT) 具有逆轉錄酶 的特
性，TERT被認為是端粒酶活性表達的關鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致，與端粒酶的活化程度密切相關。 因此，對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。
本產品試劑盒采用雙色熒光qPCR (TaqMan探針法) 檢測端粒酶催化亞基TERT基因和內參基因
GAPDH 。通過提取細胞RNA ，利用特異性逆轉錄引物進行逆轉錄反應， 以cDNA為模板在單管中利用多重熒光定量PCR進行擴增反應 (雙重探針： FAM 、Cy5) 。選用293T細胞為陽性對照以及MRC- 5細胞為陰性對照，判斷樣本中是否有TERT基因表達 。該試劑盒具有以下特點：
1 . 靈敏：雙色探針，靈敏度高。
2 . 穩定：全程閉管操作，無交叉污染。
3 . 可靠：含內參基因，避免假陰性。
4 . 方便：操作簡單，無需電泳步驟。
5. 定量： 以CT值判斷，可定量檢測。
【運輸及保存條件】
低溫冷凍運輸 ，避光-20℃保存 ，有效期6個月。開蓋后，4℃保存，有效期1周。
【操作步驟】
1. 逆轉錄反應
使用Trizol法抽提細胞RNA ，RNA純度A260/280在1 .9 -2 . 0之間 。取1ug RNA使用Thermo逆轉錄試劑 盒 ( 貨 號 ： K1622或K16225 ) ， 將 試 劑 盒 中 的 Random Primer 替 換 成 Biowing® Specific Reverse Transcription Primers進行反轉錄反應得到cDNA。
2. qPCR反應體系及條件
2. 1 陽性對照處理
將陽性對照cDNA進行4倍、8倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復。
2.2 陰性對照處理
將陰性對照cDNA進行4倍、8倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復。
2.3 樣本處理
將待測樣本cDNA進行4倍稀釋作為測試濃度，每個樣本做三重復。
【基線設置】
(以ABI 7500為例)
一般默認起始和終止基線位置為3 - 15個循環，應根據內參基因和TERT基因實際擴增曲線手動將基線起始循環數調整為指數增長期之前即可。
【閾值設置】
(以ABI 7500為例)
內參閾值設定： 以陽性對照4倍稀釋cDNA定內參基因擴增曲線閾值， 內參基因(Cy5)初始濃度的CT值定為17±3；
TERT閾值設定： 以陽性對照4倍稀釋cDNA定TERT基因擴增曲線閾值，TERT基因(FAM)初始濃度CT值的定為25±3。
【結果判讀】
1. 陽性對照4倍稀釋后TERT基因Ct值在25±3 ， 內參基因Ct值在17±3 ，8倍稀釋后TERT基因Ct值在26±3， 內參基因Ct值在18±3 。TERT基因和內參基因之間∆CT維持在9±3，保持穩定。
2 . 陰性對照經4倍、8倍梯度稀釋后，TERT基因Ct值≥35 (或檢測不到) ， 內參基因Ct值仍在18±3之間，判定為端粒酶活性為陰性。
3. 結果說明
若待測樣本內參基因Ct值在17±3之間，TERT基因Ct值＜35且擴增曲線正常，則樣本端粒酶活性
為陽性。
若待測樣本內參基因Ct值在17±3之間，TERT基因Ct值≥35且無明顯的擴增曲線則樣本無端粒酶
活性。
【說明】
1 . 待測樣本cDNA 4倍稀釋作為模板，三次技術重復，不設置梯度稀釋； 陽性對照、 陰性對照進行4倍、8倍梯度稀釋，建議分別做三重復；避免偶然誤差的產生。
2. 如果陽性/陰性對照4倍稀釋后內參基因Ct值＞20 ，表明參考品有降解或者試劑盒擴增效率下降。
3. 如果所有樣本4倍稀釋后內參基因Ct值＞20 ，表明試劑盒的擴增效率下降。
4. 如果陽性對照4倍稀釋后TERT基因Ct值＞28 ，表明TERT基因檢測系統失效。
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