視網膜母細胞瘤（RB）是一種兒童眼內腫瘤，如果不治療，會導致完全失明，并在晚期嚴重時死亡，近年來科學家通過開發針對RB細胞的靶向治療來拯救患兒的視力和生命。視網膜主要由甘油磷脂組成，進一步可分類為磷脂（PE）和磷脂酰膽堿（PC）。用質譜成像技術（DESI MS）進行脂質成像檢測是精確測量組織代謝產物和研究正常和癌變組織之間脂質變化的強有力的手段之一。基于DESI MS的脂質成像有助于視網膜疾病的研究，本篇文章主要以視網膜母細胞瘤（RB）作為研究對象，通過DESI-MS和免疫組學等技術，更深入地探究了NCL-APT核糖核酸酶適體對RB的調節治療作用。
 

Kamalnayan Bajaj視力和眼科研究的Subramanian Krishnakumar教授在Molecular Therapy—Nucleic Acids發表的題為 “Nucleolin-aptamer therapy in retinoblastoma: molecular changes and mass spectrometry–based imaging ”（IF：11.454）的研究成果，通過DESI-MS成像技術、流式細胞術、qPCR、免疫組織化學、免疫印跡分析等技術，發現了核仁適體(NCL-APT)治療RB特征，探究了NCL-APT調節RB機理，描繪了NCL-APT的DESI-MS脂質成像圖譜，為NCL-APT的RB靶向治療提供了理論依據。
 

1. RB中NCL的表達和NCL-APT的攝取

通過qPCR、免疫組織化學、流式細胞術和免疫印跡分析RB腫瘤樣本的NCL，發現RB細胞系Y79和WERI-Rb1和RB腫瘤細胞質中的NCL均顯著上調。RB腫瘤細胞質和細胞表面的NCL水平升高，可有助于攝取RB腫瘤細胞中的NCL-APT。NCL-APT周期變化中，WERI-Rb1的G0-G1期增加，Y79的S期停滯。表明NCL在RB細胞和細胞系中差異表達，NCL-APT產生周期性變化（圖1）。

圖1 核仁素在RB腫瘤樣本和細胞系中的表達

2. NCL-APT調節RB中的致癌miRNA

作者研究NCL-APT對RB的miRNA表達影響。通過微陣列分析，顯示miRNA顯著下調。NCL-APT處理后miRNA仍下調，qPCR在WERI-Rb1細胞中作用顯著。說明miRNA譜中其他下調的miRNA表達變化也得到了驗證（圖2）。

 圖2 NCL-APT對miRNA表達的影響

3. NCL-APT在體外和體內干擾RB：對miRNA、凋亡蛋白的影響

作者采用MTT研究RB、MIO-M1細胞系中NCL-APT生長和增殖。但細胞分裂的抑制導致細胞毒性，使RB細胞系的生存能力降低。通過RB和MIO-M1細胞系的細胞活力測試，證實了NCL-APT活性的特異性（圖3）。

圖3 NCL-APT對細胞增殖的影響

NCL-APT和LNA-NCL-APT在Y79異種移植小鼠的腫瘤部位附近皮下（皮下）治療，顯示腫瘤生長減少。說明不同治療中切除的腫瘤大小差異明顯（圖4）。

圖4 NCL-APT和LNA-NCL-APT的Y79異種移植物模型

采用微陣列觀察NCL-APT處理的miRNA，發現miRNA在異種移植的腫瘤組織中被下調。表明NCL-APT對miRNA的影響導致腫瘤發生變化。實驗通過正常裸鼠血清miRNA與Y79異種移植小鼠血清相比，顯示miR-18a和miR-19b-1表達水平升高。NCL-APT皮下注射和LNA-NCL-APT腹腔注射組比較發現，所有治療組中miR-18a表達受影響程度相似。免疫印跡分析顯示，不同模式下FOXM1表達不同，但表達均下調。說明體外和體內NCL-APT治療對RB生長的抑制是由mRNA、致癌miRNA和凋亡標志物進行整合調節介導的（圖5）。

圖5 Y79異種移植物上NCL-APT和

LNA-NCL-APT治療后的分子變化

4. LNA-NCL-APT介導的凋亡標志物變化和細胞因子水平：整合體分析

LNA-NCL-APT處理的異種移植物中腫瘤凋亡蛋白和細胞因子發生變化。蛋白質陣列用PBS和LNA-NCL-APT處理的腫瘤組織研究凋亡標記物，顯示外源性和內源性途徑介質的顯著差異。LNA-NCL-APT治療中，趨化細胞因子和促有絲分裂細胞因子混合表達。LNA-NCL-APT腹腔注射治療組織的IHC研究也顯示細胞核PCNA表達水平下降。綜合網絡建模和分析，揭示了關鍵途徑、基因等在NCL-APT治療過程中的變化（圖5）。

5. 異種移植組織的脂質譜分析

通過MS/MS和數據庫檢索，在DESI  MS中不同RB細胞系中觀察到的高強度峰，與未處理組相比有顯著差異（圖6）。NCL-APT和LNA-NCL-APT治療Y79異種移植物，分析皮下注射和腹腔注射的脂質質譜。腫瘤切片分析顯示NCL-APT皮下注射的脂質強度降低，少數組織區域變化不明顯（圖7）。說明脂質水平的變化與適體有關，因為脂質合成的抑制或水平的降低直接影響細胞增殖。

圖6 RB細胞系DESI MS成像

圖7 NCL-APT和LNA-NCL-APT體內評估后PC水平的變化

通過免疫組學、質譜成像（DESI-MS）等技術，探究NCL-APT對視網膜母細胞瘤（RB）的表達和治療。通過體外、體內NCL-APT對RB的影響，說明通過調節mRNA、致癌miRNA和凋亡標志物可抑制RB生長。脂質合成的抑制或水平的降低也直接影響RB的細胞增殖。同時，也進一步證實了NCL-APT治療RB的有效性，也為RB的靶向治療提供新思路。

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