全基因組ChIP-seq分析揭示細菌轉錄因子PhoB的基因內結合位點
細菌編碼許多轉錄因子（transcription factor，TF），這些轉錄因子通過與啟動子周圍的DNA結合并調控RNA聚合酶（RNAP）全酶以結合啟動子DNA或異構化為主動轉錄構象的能力來調節轉錄起始。目前對TF功能的研究幾乎集中在調節基因上游基因間區域的TF結合位點。然而，基因組規模分析鑒定出大量的TF結合位點位于基因內（within genes），基因內TF結合位點的比例在不同TF之間具有顯著差異。盡管基因內存在大量TF結合位點，但對其功能知之甚少。
大腸桿菌（Escherichia coli）TF PhoB是一種保守的轉錄因子，可調控參與磷酸鹽穩態的基因轉錄。大部分PhoB結合位點位于基因內，這些基因內結合位點與可檢測的轉錄調控無關，且在進化上不保守。許多基因內PhoB位點位于H-NS結合區域，可能是由于PhoB和H-NS的共同序列偏好。
2023年04月17日，《mBio》雜志發表了題為“Genome-Wide Mapping of the Escherichia coli PhoB Regulon Reveals Many Transcriptionally Inert, Intragenic Binding Sites”的研究論文，該研究通過對細菌轉錄因子PhoB結合位點的ChIP-seq、RNA-seq整合分析，揭示了大腸桿菌PhoB的許多基因內轉錄因子結合位點和轉錄調控機制。
標題：Genome-Wide Mapping of the Escherichia coli PhoB Regulon Reveals Many Transcriptionally Inert, Intragenic Binding Sites.（大腸桿菌PhoB調控元件的全基因組定位揭示了許多轉錄惰性的基因內結合位點）
時間：2023-04-17
期刊：mBio
影響因子：IF 7.786
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq、RT-qPCR等
研究摘要：
基因組規模分析揭示許多轉錄因子結合位點在基因內部，引發了關于這些結合位點功能的問題。最近研究揭示細菌基因內的大量轉錄因子結合位點，但絕大多數結合位點的功能尚未研究。本研究繪制了轉錄因子PhoB在大腸桿菌基因組中的結合，揭示了大多數PhoB結合位點都位于基因內。分析結果表明，基因內PhoB結合位點與重疊基因調控無關。數據揭示了細菌可以耐受大量非調控性基因內轉錄因子結合位點的存在，且這些結合位點不受選擇性壓力影響。
研究使用染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）和轉錄組測序（RNA-seq）對pho調控元件進行高分辨率的全基因組分析。研究對一組已知的pho調控基因進行分析和擴展，并鑒定出許多基因內PhoB結合位點。分析結果顯示，絕大多數基因內PhoB結合位點不保守，且與可檢測的調控功能無關。本研究數據表明，單個基因內PhoB位點無功能，轉錄因子可以結合許多基因內位點，對局部轉錄（local transcription）幾乎沒有影響。
實驗結果：
（1）磷酸鹽限制條件下PhoB的全基因組結合
圖1：C末端帶有FLAG3標簽的PhoB活性部分降低。qRT-PCR檢測在低磷酸鹽條件下生長的細胞中，野生型MG1655/pBAD24（wild type）、MG1655 ΔphoB（CDS091）/pBAD24（ΔphoB）和MG1655 phoB-FLAG3（DMF34）/pBAD24（phoB-FLAG3）中相對minD RNA對照的pstS RNA水平。值是三個生物學重復平均值；誤差線表示±1個標準差。
圖2：ChIP-seq鑒定PhoB結合位點。
表1：ChIP-seq鑒定的PhoB結合區域列表
圖3：ChIP-seq和ChIP-ChIP數據集比較分析
（2）pho調控元件的再評估
圖4：大腸桿菌野生型和ΔphoB菌株的RNA-seq分析。散點圖顯示野生型（MG1655/pBAD24）或ΔphoB（CDS091/pBAD24）細胞中所有基因的相對RNA水平。每個數據點對應一個基因，三角形數據點代表先前報道的pho調控元件中的基因，紅色三角形表示該轉錄本ChIP-seq鑒定的上游PhoB位點，灰色三角形表示沒有上游位點。紅色圓圈表示以前沒有報道過的基因位于pho調控元件中，但在ChIP-seq中鑒定出上游PhoB位點。藍色圓圈表示ChIP-seq鑒定出的內部PhoB位點基因。灰色圓圈表示所有其他基因。
圖5：pho調控元件潛在成員基因中RNAP（β亞基）占有率差異。
野生型MG1655（深色條）和MG1655 ΔphoB（CDS091；淺色條）中，ChIP-qPCR檢測的RNAP（β亞基）占有率是pho調控元件潛在成員的基因內區域。左側示意圖顯示上游或內部PhoB位點的基因（紅色垂直線）。水平條表示ChIP-qPCR中PCR擴增子位點，黑色條表示PhoB位點上游基因內的擴增子，綠色條表示基因內PhoB位點上游的擴增子，藍色條表示基因內PhoB位點下游的擴增子。
（3）起始RNAP的PhoB依賴性招募
圖6：野生型和ΔPhoB細胞PhoB結合位點周圍σ70占有率差異。
散點圖顯示ChIP-seq鑒定的phoB結合位點周圍400bp區域在野生型MG1655和MG1655 ΔphoB（DMF84）中的歸一化σ70占有率。每個數據點代表一個PhoB結合位點。基因間結合位點由紅色數據點表示，基因內結合位點由藍色數據點表示。與PhoB結合位點相關的基因在野生型和ΔPhoB細胞的σ70占有率相差>2倍。
（4）H-NS與許多基因內PhoB位點相關聯，但不阻斷RNAP招募
圖7：H-NS抑制許多啟動子的轉錄
圖8：H-NS不抑制PhoB依賴性起始RNA聚合酶招募效應
（5）PhoB結合位點的序列保守性
圖9：PhoB結合位點在γ -變形菌屬（Gammaproteobacteria）物種中的保守性
參考文獻：
Fitzgerald DM, Stringer AM, Smith C, Lapierre P, Wade JT. Genome-Wide Mapping of the Escherichia coli PhoB Regulon Reveals Many Transcriptionally Inert, Intragenic Binding Sites. mBio. 2023 Apr 17:e0253522.
大腸桿菌（Escherichia coli）TF PhoB是一種保守的轉錄因子，可調控參與磷酸鹽穩態的基因轉錄。大部分PhoB結合位點位于基因內，這些基因內結合位點與可檢測的轉錄調控無關，且在進化上不保守。許多基因內PhoB位點位于H-NS結合區域，可能是由于PhoB和H-NS的共同序列偏好。
2023年04月17日，《mBio》雜志發表了題為“Genome-Wide Mapping of the Escherichia coli PhoB Regulon Reveals Many Transcriptionally Inert, Intragenic Binding Sites”的研究論文，該研究通過對細菌轉錄因子PhoB結合位點的ChIP-seq、RNA-seq整合分析，揭示了大腸桿菌PhoB的許多基因內轉錄因子結合位點和轉錄調控機制。
標題：Genome-Wide Mapping of the Escherichia coli PhoB Regulon Reveals Many Transcriptionally Inert, Intragenic Binding Sites.（大腸桿菌PhoB調控元件的全基因組定位揭示了許多轉錄惰性的基因內結合位點）時間：2023-04-17
期刊：mBio
影響因子：IF 7.786
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq、RT-qPCR等
研究摘要：
基因組規模分析揭示許多轉錄因子結合位點在基因內部，引發了關于這些結合位點功能的問題。最近研究揭示細菌基因內的大量轉錄因子結合位點，但絕大多數結合位點的功能尚未研究。本研究繪制了轉錄因子PhoB在大腸桿菌基因組中的結合，揭示了大多數PhoB結合位點都位于基因內。分析結果表明，基因內PhoB結合位點與重疊基因調控無關。數據揭示了細菌可以耐受大量非調控性基因內轉錄因子結合位點的存在，且這些結合位點不受選擇性壓力影響。
研究使用染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）和轉錄組測序（RNA-seq）對pho調控元件進行高分辨率的全基因組分析。研究對一組已知的pho調控基因進行分析和擴展，并鑒定出許多基因內PhoB結合位點。分析結果顯示，絕大多數基因內PhoB結合位點不保守，且與可檢測的調控功能無關。本研究數據表明，單個基因內PhoB位點無功能，轉錄因子可以結合許多基因內位點，對局部轉錄（local transcription）幾乎沒有影響。
實驗結果：
（1）磷酸鹽限制條件下PhoB的全基因組結合
圖1：C末端帶有FLAG3標簽的PhoB活性部分降低。qRT-PCR檢測在低磷酸鹽條件下生長的細胞中，野生型MG1655/pBAD24（wild type）、MG1655 ΔphoB（CDS091）/pBAD24（ΔphoB）和MG1655 phoB-FLAG3（DMF34）/pBAD24（phoB-FLAG3）中相對minD RNA對照的pstS RNA水平。值是三個生物學重復平均值；誤差線表示±1個標準差。圖2：ChIP-seq鑒定PhoB結合位點。
- ChIP-seq數據：（i）低磷酸鹽條件下的無標簽對照，（ii）低磷酸鹽條件下的PhoB-FLAG3標簽，（iii）高磷酸鹽條件下的PhoB-FLAG3標簽。三個基因組區域，其中一個數據來自兩個生物學重復。x軸表示基因組位點。y軸表示歸一化序列reads覆蓋范圍，正值表示序列reads比對到正義鏈，負值表示序列reads比對到反義鏈。
- 每個ChIP-seq peaks周圍100 bp區域顯著富集的DNA序列motif。
- PhoB結合位點相對于ChIP-seq peaks中心區域位點分析。
- ChIP-seq鑒定的PhoB結合位點的基因組背景餅圖。“基因內和上游”位點是基因內但注釋基因起始上游＜200bp位點。
表1：ChIP-seq鑒定的PhoB結合區域列表圖3：ChIP-seq和ChIP-ChIP數據集比較分析
- 本研究ChIP-seq數據和已發表的ChIP-ChIP數據集之間的共有區域中，每個ChIP-seq peaks周圍100 bp區域顯著富集的DNA序列motif。
- 本研究ChIP-seq數據的特異性區域，每個ChIP-seq peaks周圍100 bp區域顯著富集的DNA序列motif。
（2）pho調控元件的再評估
圖4：大腸桿菌野生型和ΔphoB菌株的RNA-seq分析。散點圖顯示野生型（MG1655/pBAD24）或ΔphoB（CDS091/pBAD24）細胞中所有基因的相對RNA水平。每個數據點對應一個基因，三角形數據點代表先前報道的pho調控元件中的基因，紅色三角形表示該轉錄本ChIP-seq鑒定的上游PhoB位點，灰色三角形表示沒有上游位點。紅色圓圈表示以前沒有報道過的基因位于pho調控元件中，但在ChIP-seq中鑒定出上游PhoB位點。藍色圓圈表示ChIP-seq鑒定出的內部PhoB位點基因。灰色圓圈表示所有其他基因。
圖5：pho調控元件潛在成員基因中RNAP（β亞基）占有率差異。
野生型MG1655（深色條）和MG1655 ΔphoB（CDS091；淺色條）中，ChIP-qPCR檢測的RNAP（β亞基）占有率是pho調控元件潛在成員的基因內區域。左側示意圖顯示上游或內部PhoB位點的基因（紅色垂直線）。水平條表示ChIP-qPCR中PCR擴增子位點，黑色條表示PhoB位點上游基因內的擴增子，綠色條表示基因內PhoB位點上游的擴增子，藍色條表示基因內PhoB位點下游的擴增子。
（3）起始RNAP的PhoB依賴性招募
圖6：野生型和ΔPhoB細胞PhoB結合位點周圍σ70占有率差異。
散點圖顯示ChIP-seq鑒定的phoB結合位點周圍400bp區域在野生型MG1655和MG1655 ΔphoB（DMF84）中的歸一化σ70占有率。每個數據點代表一個PhoB結合位點。基因間結合位點由紅色數據點表示，基因內結合位點由藍色數據點表示。與PhoB結合位點相關的基因在野生型和ΔPhoB細胞的σ70占有率相差>2倍。
（4）H-NS與許多基因內PhoB位點相關聯，但不阻斷RNAP招募
圖7：H-NS抑制許多啟動子的轉錄
- 通過ChIP-seq鑒定的野生型MG1655和MG1655 Δhns（AMD565a）PhoB結合位點周圍400 bp區域的歸一化σ70占有率散點圖。
- 通過ChIP-seq檢測MG1655Δhns（AMD565a）細胞中所有σ70結合位點，鑒定出野生型MG1655和MG1655 Δhns（AMD565a）的歸一化化σ70占有率散點圖。
圖8：H-NS不抑制PhoB依賴性起始RNA聚合酶招募效應
（5）PhoB結合位點的序列保守性
圖9：PhoB結合位點在γ -變形菌屬（Gammaproteobacteria）物種中的保守性參考文獻：
Fitzgerald DM, Stringer AM, Smith C, Lapierre P, Wade JT. Genome-Wide Mapping of the Escherichia coli PhoB Regulon Reveals Many Transcriptionally Inert, Intragenic Binding Sites. mBio. 2023 Apr 17:e0253522.
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