m5C高甲基化介導EGFR突變的非小細胞肺癌耐藥潛在機理
對EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）的固有耐藥（Intrinsic resistance）和獲得耐藥(acquired resistance)是EGFR突變型非小細胞肺癌(NSCLC)患者治療失敗的主要原因，然而EGFR-TKI的固有耐藥性背后的機制在很大程度上仍然未知。
5-甲基胞嘧啶（m5C）是哺乳動物mRNA的重要轉錄后修飾，其由NOP2/Sun結構域（NSUN）RNA甲基轉移酶或DNA甲基轉移酶2（DNMT2）催化，并可通過TET甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET2）去甲基化。Aly/REF出核因子（ALYREF）識別m5C修飾的mRNA以促進mRNA出核，而Y盒結合蛋白1（YBX1）直接結合m5C甲基化的mRNA以穩定mRNA。m5C異常修飾與膀胱癌、胃癌和食管鱗癌的發病和發展有關。m5C修飾在各種腫瘤的發病機制中起著至關重要的作用，然而RNA m5C修飾在腫瘤耐藥性中的作用和分子機制尚不清楚。
2023年05月09日，鄭州大學田鑫教授團隊、闞全程教授團隊與中國科學院北京基因組研究所楊運桂團隊合作在《Molecular Cancer》雜志上發表題為“Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer”的研究論文，該研究揭示了通過NSUN2-YBX1-QSOX1軸的異常RNA m5C修飾在介導EGFR突變型NSCLC對吉非替尼固有耐藥性中的關鍵功能。
標題：Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer（在EGFR突變型非小細胞肺癌中，異常m5C高甲基化通過NSUN2/YBX1/QSOX1軸介導對吉非替尼的固有耐藥）
時間：2023.05.09
期刊：Molecular Cancer
影響因子：IF 41.444
技術平臺：功能實驗、質粒轉染、RNA-BS、mRNA-seq、MeRIP-qPCR、Western blot等
樣本：人肺腺癌細胞系PC-9、HCC827、HCC2935、HCC4006、H1650、HCC2279、H1975細胞，藥物敏感或固有耐藥EGFR-TKI的NSCLC患者肺腺癌組織
研究摘要：
該研究通過在非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系和患者樣本中檢測RNA m5C甲基化、m5C writer NOP2/Sun RNA甲基轉移酶家族成員2（NSUN2）與EGFR-TKI耐藥的相關性。通過體外和體內功能獲得實驗和功能喪失試驗研究了NSUN2對EGFR-TKI耐藥性的影響。通過RNA測序（RNA-seq）、亞硫酸鹽RNA測序（RNA-BS）和m5C甲基化RNA免疫沉淀qPCR（MeRIP-qPCR）鑒定NSUN2參與EGFR-TKI耐藥的靶基因。此外，通過功能拯救實驗和嘌呤霉素摻入實驗研究了NSUN2對靶基因表達的調控機制。
結果表明，RNA m5C高甲基化和NSUN2與EGFR-TKI的固有耐藥性顯著相關。NSUN2過表達導致吉非替尼耐藥和腫瘤復發，而NSUN2基因抑制導致腫瘤消退，并在體外和體內克服了對吉非替尼的固有耐藥性。整合RNA-seq和m5C-BS分析結果，表明QSOX1（quiescin sulfhydryl oxidase 1）是m5C異常修飾的潛在靶點。NSUN2甲基化QSOX1編碼序列區域，通過m5C readers Y-box結合蛋白1（YBX1）增強QSOX1翻譯。NSUN2-YBX1-QSOX1通路的基因沉默克服了非小細胞肺癌中固有的吉非替尼耐藥性。本研究揭示了先前未被識別的NSUN2-YBX1-QSOX1軸信號在對EGFR-TKI固有耐藥的NSCLC患者的預后和治療中的作用。
研究結果：
（1）m5C高甲基化和NSUN2與吉非替尼固有耐藥性相關
圖1：m5C高甲基化和NSUN2穩定表達與NSCLC吉非替尼的固有耐藥相關
a. 以梯度濃度的吉非替尼或奧希替尼處理NSCLC細胞72 h，并用CCK-8法檢測其IC50值。
b. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h，ELISA法檢測mRNA m5C水平。
c. 吉非替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h，繪制微陣列分析中RNA m5C甲基化轉移酶和去甲基化酶的基因表達熱圖。
d. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h， qRT-PCR檢測NSUN2 mRNA表達。
e. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h后，用相應抗體進行western blot分析全細胞裂解物。
f-g. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者NSUN2和p-EGFR的IHC染色代表性圖像(f)和治療前后活檢的定量H-scores評分(g)。
h. TCGA-LUAD數據集中NSUN2與耐藥標志物或抑癌基因的相關性基因表達分析。
數據為三次生物學重復實驗的平均值±SD。Ns（不顯著），Ctrl（對照），Gef（吉非替尼），Osi（奧希替尼），*p < 0.05， **p < 0.01。
（2）NSUN2過表達促進吉非替尼體內和體外耐藥
圖2：NSUN2過表達導致吉非替尼耐藥和腫瘤復發
a. 對PC-9細胞穩定轉染野生型NSUN2 (NSUN2-WT)、雙催化突變型NSUN2 (NSUN2-DM)和空載體質粒(Mock)的 NSUN2表達進行western blot分析。
b. 以梯度濃度吉非替尼處理PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細胞72 h，采用CCK-8法檢測細胞活力及吉非替尼IC50。
c. 吉非替尼(1µM)處理PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細胞24 h后，western blot分析NSUN2蛋白水平。
d-f. BALB/c裸鼠皮下植入PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細胞(每組n≥6個)的腫瘤體積(d)、腫瘤重量(e)和小鼠生存期(f)。注射后約2周，分別給予吉非替尼25 mg/kg或0.5% CMC-Na灌胃，1次/ d，連續10 d(第15~24天)。
g. 從腫瘤異種移植獲得的腫瘤ki67 IHC染色和定量H-scores評分代表性圖像。
（3）NSUN2敲除可克服吉非替尼固有耐藥
圖3：NSUN2敲除在體外和體內克服了吉非替尼的固有耐藥性。
a. 將靶向NSUN2 siRNA（siNSUN2）轉染或非靶向對照siRNA（siCtrl）轉染的H1650和H1975細胞用吉非替尼（1µM）處理72 h，并通過CCK-8法檢測細胞活力，NSUN2敲除效果使用western blot進行評估分析（上圖）。
b. 用吉非替尼(1µM)處理轉染siNSUN2或siCtrl的H1650和H1975細胞72 h, 通過Annexin V-FITC/PI染色檢測細胞凋亡;
c. H1650細胞轉染siNSUN2或shNSUN2后，western blot分析檢測EGFR蛋白表達。
d-e. 經shNSUN2預處理的H1650和H1975細胞用NSUN2-WT或NSUN2-DM穩定轉染，通過CCK-8 (d)或克隆形成實驗(e)檢測細胞增殖，通過western blot (右圖)分析NSUN2的拯救效果。
f-g. 皮下植入H1650-shCtrl和H1650-shNSUN2細胞的BALB/c裸鼠獲得的腫瘤異種移植物的平均體積(f)和腫瘤重量(g)（每組n=7）。
h-i. 皮下植入小鼠模型中H1975-shCtrl和h1975 - shnsun2來源的腫瘤異種移植物的生長曲線(h)和平均腫瘤重量(i)(每組n =6)。
（4）YBX1可以作為m5C reader提高吉非替尼耐藥性
圖4：m5C reader YBX1表達是吉非替尼固有耐藥所必需的
a. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h, western blot檢測YBX1蛋白表達水平。
b. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h后，qRT-PCR檢測YBX1 mRNA表達。c-d. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者治療前后活檢YBX1 的IHC染色（c）和定量H-scores評分（d）。
e-f. 以吉非替尼(1µM)處理轉染YBX1 siRNA的H1650和H1975細胞72 h，采用CCK-8法檢測細胞活力(e)， Annexin V-FITC/PI染色法檢測細胞凋亡(f)。
g. western blot檢測siYBX1轉染H1975細胞EGFR蛋白表達。
h-i. 將shYBX1預處理的H1650細胞用野生型YBX1（YBX1-WT）或結合缺陷突變型YBX1 (YBX1- Mut, W65A) 穩定轉染，并通過CCK-8 (h)或集落形成實驗(i)檢測細胞增殖。
j-k. 皮下植入BALB/c裸鼠從H1650-shCtrl和H1650-shYBX1異種移植物的腫瘤生長（j）和腫瘤重量（k）（n ≥ 5)。
l. 從H1650-shCtrl和H1650-shYBX1異種移植物獲得的腫瘤ki67 IHC染色和定量H-scores評分代表性圖像。
（5）QSOX1被鑒定為NSUN2介導的m5C高甲基化的潛在靶點
圖5：表觀轉錄組分析鑒定QSOX1是耐藥NSCLC細胞中m5C修飾的靶標。
a-b. H1650細胞（a）和PC-9細胞（b）siNSUN2轉染72h或吉非替尼（1µM）處理24h后，通過RNA-BS分析m5C平均水平。
c. m5C在對照組、NSUN2敲低組和吉非替尼處理組的H1650細胞不同區域分布。
d. H1650 siNSUN2#1細胞中m5C甲基化水平和mRNA表達水平發生顯著變化。
e. 維恩圖顯示了直接靶向NSUN2的潛在m5C修飾候選基因。
f-g. IGV分析顯示，NSUN2敲低或吉非替尼處理后，H1650 細胞(f)和PC-9細胞 (g)中QSOX1的mRNA表達和m5C水平發生變化。
h-j. 用抗m5C抗體免疫共沉淀純化mRNA, qRT-PCR分析H1650 (h)、H1975 (i)和HCC2279 (j)中QSOX1的m5C水平。
（6）NSUN2以m5C-YBX1依賴的方式調控QSOX1 mRNA翻譯
圖6：NSUN2和YBX1通過調控mRNA翻譯來調節QSOX1表達
a. 用siNSUN2或siCtrl轉染H1650和H1975細胞72 h后，用相應抗體western blot分析全細胞裂解物。
b. 從H1650-shCtrl和H1650-shNSUN2異種移植物獲得的腫瘤QSOX1 IHC染色和定量H-scores評分代表性圖像。
c. 用siNSUN2預處理的H1650細胞用pcDNA-NSUN2-WT或pcDNA-NSUN2-Mut (C271A&C321A)質粒轉染，western blot分析QSOX1表達。
d. 用200 nM嘌呤霉素處理siCtrl或siNSUN2轉染的H1650或H1975細胞，用相應抗體western blot分析分析全細胞裂解物。
e. 將含有野生型或突變型(C-to-T/A突變) m5C位點的QSOX1 CDS克隆到熒光素酶報告載體中。
f. 分別轉染shCtrl和shNSUN2的H1650細胞中，野生型和突變型QSOX1 CDS報告載體的相對熒光素酶活性。
g. western blot分析siCtrl和siYBX1轉染的H1650和H1975細胞中QSOX1表達。
h. 以IgG為對照，用抗YBX1抗體在siCtrl或siNSUN2轉染的H1650細胞中進行YBX1和QSOX1 mRNA免疫共沉淀。
i. 經shYBX1預處理的H1650細胞用3FLAG-YBX1-WT或3FLAG-YBX1-Mut (W65A)質粒轉染，western blot分析QSOX1表達。
j. 用200 nM嘌呤霉素處理siCtrl或siYBX1轉染的H1650或H1975細胞，用相應抗體進行western blot分析全細胞裂解物。
k. H1650細胞分別轉染shCtrl和shYBX1后，野生型和突變型QSOX1 CDS報告載體的相對熒光素酶活性。l. 用siNSUN2或siYBX1單獨或聯合轉染H1650細胞72 h后，用相應抗體western blot分析全細胞裂解物。
（7）QSOX1與吉非替尼固有耐藥性相關
c. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h, western blot分析QSOX1蛋白表達水平。
d. 用吉非替尼(1µM)處理經靶向QSOX1（siQSOX1）或非靶向對照（siCtrl）siRNA轉染的H1650和H1975細胞72 h，采用CCK-8法檢測細胞活力。
e-f. 經shNSUN2預處理的H1650細胞m5C位點用野生型QSOX1 (QSOX1-WT)或突變型QSOX1 (QSOX1-Mut)穩定轉染，采用CCK-8 (e)或集落形成實驗(f)檢測細胞增殖。
g-h. BALB/c裸鼠皮下移植H1975-shCtrl和H1975-shQSOX1細胞異種移植物的的腫瘤生長曲線(g)和腫瘤重量(h) (每組n=7)。
i. TCGA-LUAD數據集的Kaplan-Meier分析顯示NSUN2、YBX1和QSOX1聯合高表達預測較差的總生存率。采用對數秩檢驗確定P值(P=0.016)。
j. 非小細胞肺癌中異常m5C高甲基化通過NSUN2/YBX1/QSOX1軸導致吉非替尼固有耐藥性的工作模型。
結論
本研究表明，NSUN2-YBX1-QSOX1軸是調控NSCLC對EGFR-TKI固有耐藥性的重要機制。抑制NSUN2-YBX1-QSOX1軸可以通過m5C依賴性調節機制克服吉非替尼的固有耐藥性。研究結果強調了NSUN2-YBX1-QSOX1軸可以作為EGFR-TKI固有耐藥的NSCLC患者預后和治療的候選生物標志物。
參考文獻：
Wang Y, Wei J, Feng L, Li O, Huang L, Zhou S, Xu Y, An K, Zhang Y, Chen R, He L, Wang Q, Wang H, Du Y, Liu R, Huang C, Zhang X, Yang YG, Kan Q, Tian X. Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Mol Cancer. 2023 May 9;22(1):81.
5-甲基胞嘧啶（m5C）是哺乳動物mRNA的重要轉錄后修飾，其由NOP2/Sun結構域（NSUN）RNA甲基轉移酶或DNA甲基轉移酶2（DNMT2）催化，并可通過TET甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET2）去甲基化。Aly/REF出核因子（ALYREF）識別m5C修飾的mRNA以促進mRNA出核，而Y盒結合蛋白1（YBX1）直接結合m5C甲基化的mRNA以穩定mRNA。m5C異常修飾與膀胱癌、胃癌和食管鱗癌的發病和發展有關。m5C修飾在各種腫瘤的發病機制中起著至關重要的作用，然而RNA m5C修飾在腫瘤耐藥性中的作用和分子機制尚不清楚。
2023年05月09日，鄭州大學田鑫教授團隊、闞全程教授團隊與中國科學院北京基因組研究所楊運桂團隊合作在《Molecular Cancer》雜志上發表題為“Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer”的研究論文，該研究揭示了通過NSUN2-YBX1-QSOX1軸的異常RNA m5C修飾在介導EGFR突變型NSCLC對吉非替尼固有耐藥性中的關鍵功能。
標題：Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer（在EGFR突變型非小細胞肺癌中，異常m5C高甲基化通過NSUN2/YBX1/QSOX1軸介導對吉非替尼的固有耐藥）
時間：2023.05.09
期刊：Molecular Cancer
影響因子：IF 41.444
技術平臺：功能實驗、質粒轉染、RNA-BS、mRNA-seq、MeRIP-qPCR、Western blot等
樣本：人肺腺癌細胞系PC-9、HCC827、HCC2935、HCC4006、H1650、HCC2279、H1975細胞，藥物敏感或固有耐藥EGFR-TKI的NSCLC患者肺腺癌組織
研究摘要：
該研究通過在非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系和患者樣本中檢測RNA m5C甲基化、m5C writer NOP2/Sun RNA甲基轉移酶家族成員2（NSUN2）與EGFR-TKI耐藥的相關性。通過體外和體內功能獲得實驗和功能喪失試驗研究了NSUN2對EGFR-TKI耐藥性的影響。通過RNA測序（RNA-seq）、亞硫酸鹽RNA測序（RNA-BS）和m5C甲基化RNA免疫沉淀qPCR（MeRIP-qPCR）鑒定NSUN2參與EGFR-TKI耐藥的靶基因。此外，通過功能拯救實驗和嘌呤霉素摻入實驗研究了NSUN2對靶基因表達的調控機制。
結果表明，RNA m5C高甲基化和NSUN2與EGFR-TKI的固有耐藥性顯著相關。NSUN2過表達導致吉非替尼耐藥和腫瘤復發，而NSUN2基因抑制導致腫瘤消退，并在體外和體內克服了對吉非替尼的固有耐藥性。整合RNA-seq和m5C-BS分析結果，表明QSOX1（quiescin sulfhydryl oxidase 1）是m5C異常修飾的潛在靶點。NSUN2甲基化QSOX1編碼序列區域，通過m5C readers Y-box結合蛋白1（YBX1）增強QSOX1翻譯。NSUN2-YBX1-QSOX1通路的基因沉默克服了非小細胞肺癌中固有的吉非替尼耐藥性。本研究揭示了先前未被識別的NSUN2-YBX1-QSOX1軸信號在對EGFR-TKI固有耐藥的NSCLC患者的預后和治療中的作用。
研究結果：
（1）m5C高甲基化和NSUN2與吉非替尼固有耐藥性相關
圖1：m5C高甲基化和NSUN2穩定表達與NSCLC吉非替尼的固有耐藥相關
b. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h，ELISA法檢測mRNA m5C水平。
c. 吉非替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h，繪制微陣列分析中RNA m5C甲基化轉移酶和去甲基化酶的基因表達熱圖。
d. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h， qRT-PCR檢測NSUN2 mRNA表達。
e. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h后，用相應抗體進行western blot分析全細胞裂解物。
f-g. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者NSUN2和p-EGFR的IHC染色代表性圖像(f)和治療前后活檢的定量H-scores評分(g)。
h. TCGA-LUAD數據集中NSUN2與耐藥標志物或抑癌基因的相關性基因表達分析。
數據為三次生物學重復實驗的平均值±SD。Ns（不顯著），Ctrl（對照），Gef（吉非替尼），Osi（奧希替尼），*p < 0.05， **p < 0.01。
（2）NSUN2過表達促進吉非替尼體內和體外耐藥
圖2：NSUN2過表達導致吉非替尼耐藥和腫瘤復發
b. 以梯度濃度吉非替尼處理PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細胞72 h，采用CCK-8法檢測細胞活力及吉非替尼IC50。
c. 吉非替尼(1µM)處理PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細胞24 h后，western blot分析NSUN2蛋白水平。
d-f. BALB/c裸鼠皮下植入PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細胞(每組n≥6個)的腫瘤體積(d)、腫瘤重量(e)和小鼠生存期(f)。注射后約2周，分別給予吉非替尼25 mg/kg或0.5% CMC-Na灌胃，1次/ d，連續10 d(第15~24天)。
g. 從腫瘤異種移植獲得的腫瘤ki67 IHC染色和定量H-scores評分代表性圖像。
（3）NSUN2敲除可克服吉非替尼固有耐藥
圖3：NSUN2敲除在體外和體內克服了吉非替尼的固有耐藥性。
b. 用吉非替尼(1µM)處理轉染siNSUN2或siCtrl的H1650和H1975細胞72 h, 通過Annexin V-FITC/PI染色檢測細胞凋亡;
c. H1650細胞轉染siNSUN2或shNSUN2后，western blot分析檢測EGFR蛋白表達。
d-e. 經shNSUN2預處理的H1650和H1975細胞用NSUN2-WT或NSUN2-DM穩定轉染，通過CCK-8 (d)或克隆形成實驗(e)檢測細胞增殖，通過western blot (右圖)分析NSUN2的拯救效果。
f-g. 皮下植入H1650-shCtrl和H1650-shNSUN2細胞的BALB/c裸鼠獲得的腫瘤異種移植物的平均體積(f)和腫瘤重量(g)（每組n=7）。
h-i. 皮下植入小鼠模型中H1975-shCtrl和h1975 - shnsun2來源的腫瘤異種移植物的生長曲線(h)和平均腫瘤重量(i)(每組n =6)。
（4）YBX1可以作為m5C reader提高吉非替尼耐藥性
圖4：m5C reader YBX1表達是吉非替尼固有耐藥所必需的
b. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h后，qRT-PCR檢測YBX1 mRNA表達。c-d. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者治療前后活檢YBX1 的IHC染色（c）和定量H-scores評分（d）。
e-f. 以吉非替尼(1µM)處理轉染YBX1 siRNA的H1650和H1975細胞72 h，采用CCK-8法檢測細胞活力(e)， Annexin V-FITC/PI染色法檢測細胞凋亡(f)。
g. western blot檢測siYBX1轉染H1975細胞EGFR蛋白表達。
h-i. 將shYBX1預處理的H1650細胞用野生型YBX1（YBX1-WT）或結合缺陷突變型YBX1 (YBX1- Mut, W65A) 穩定轉染，并通過CCK-8 (h)或集落形成實驗(i)檢測細胞增殖。
j-k. 皮下植入BALB/c裸鼠從H1650-shCtrl和H1650-shYBX1異種移植物的腫瘤生長（j）和腫瘤重量（k）（n ≥ 5)。
l. 從H1650-shCtrl和H1650-shYBX1異種移植物獲得的腫瘤ki67 IHC染色和定量H-scores評分代表性圖像。
（5）QSOX1被鑒定為NSUN2介導的m5C高甲基化的潛在靶點
圖5：表觀轉錄組分析鑒定QSOX1是耐藥NSCLC細胞中m5C修飾的靶標。
a-b. H1650細胞（a）和PC-9細胞（b）siNSUN2轉染72h或吉非替尼（1µM）處理24h后，通過RNA-BS分析m5C平均水平。
c. m5C在對照組、NSUN2敲低組和吉非替尼處理組的H1650細胞不同區域分布。
d. H1650 siNSUN2#1細胞中m5C甲基化水平和mRNA表達水平發生顯著變化。
e. 維恩圖顯示了直接靶向NSUN2的潛在m5C修飾候選基因。
f-g. IGV分析顯示，NSUN2敲低或吉非替尼處理后，H1650 細胞(f)和PC-9細胞 (g)中QSOX1的mRNA表達和m5C水平發生變化。
h-j. 用抗m5C抗體免疫共沉淀純化mRNA, qRT-PCR分析H1650 (h)、H1975 (i)和HCC2279 (j)中QSOX1的m5C水平。
（6）NSUN2以m5C-YBX1依賴的方式調控QSOX1 mRNA翻譯
圖6：NSUN2和YBX1通過調控mRNA翻譯來調節QSOX1表達
b. 從H1650-shCtrl和H1650-shNSUN2異種移植物獲得的腫瘤QSOX1 IHC染色和定量H-scores評分代表性圖像。
c. 用siNSUN2預處理的H1650細胞用pcDNA-NSUN2-WT或pcDNA-NSUN2-Mut (C271A&C321A)質粒轉染，western blot分析QSOX1表達。
d. 用200 nM嘌呤霉素處理siCtrl或siNSUN2轉染的H1650或H1975細胞，用相應抗體western blot分析分析全細胞裂解物。
e. 將含有野生型或突變型(C-to-T/A突變) m5C位點的QSOX1 CDS克隆到熒光素酶報告載體中。
f. 分別轉染shCtrl和shNSUN2的H1650細胞中，野生型和突變型QSOX1 CDS報告載體的相對熒光素酶活性。
g. western blot分析siCtrl和siYBX1轉染的H1650和H1975細胞中QSOX1表達。
h. 以IgG為對照，用抗YBX1抗體在siCtrl或siNSUN2轉染的H1650細胞中進行YBX1和QSOX1 mRNA免疫共沉淀。
i. 經shYBX1預處理的H1650細胞用3FLAG-YBX1-WT或3FLAG-YBX1-Mut (W65A)質粒轉染，western blot分析QSOX1表達。
j. 用200 nM嘌呤霉素處理siCtrl或siYBX1轉染的H1650或H1975細胞，用相應抗體進行western blot分析全細胞裂解物。
k. H1650細胞分別轉染shCtrl和shYBX1后，野生型和突變型QSOX1 CDS報告載體的相對熒光素酶活性。l. 用siNSUN2或siYBX1單獨或聯合轉染H1650細胞72 h后，用相應抗體western blot分析全細胞裂解物。
（7）QSOX1與吉非替尼固有耐藥性相關
圖7：QSOX1豐度調控NSCLC對吉非替尼的敏感性
a-b. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者治療前后活檢QSOX1 IHC染色（a）和定量H-scores評分（b）代表性圖像。c. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細胞24 h, western blot分析QSOX1蛋白表達水平。
d. 用吉非替尼(1µM)處理經靶向QSOX1（siQSOX1）或非靶向對照（siCtrl）siRNA轉染的H1650和H1975細胞72 h，采用CCK-8法檢測細胞活力。
e-f. 經shNSUN2預處理的H1650細胞m5C位點用野生型QSOX1 (QSOX1-WT)或突變型QSOX1 (QSOX1-Mut)穩定轉染，采用CCK-8 (e)或集落形成實驗(f)檢測細胞增殖。
g-h. BALB/c裸鼠皮下移植H1975-shCtrl和H1975-shQSOX1細胞異種移植物的的腫瘤生長曲線(g)和腫瘤重量(h) (每組n=7)。
i. TCGA-LUAD數據集的Kaplan-Meier分析顯示NSUN2、YBX1和QSOX1聯合高表達預測較差的總生存率。采用對數秩檢驗確定P值(P=0.016)。
j. 非小細胞肺癌中異常m5C高甲基化通過NSUN2/YBX1/QSOX1軸導致吉非替尼固有耐藥性的工作模型。
結論
本研究表明，NSUN2-YBX1-QSOX1軸是調控NSCLC對EGFR-TKI固有耐藥性的重要機制。抑制NSUN2-YBX1-QSOX1軸可以通過m5C依賴性調節機制克服吉非替尼的固有耐藥性。研究結果強調了NSUN2-YBX1-QSOX1軸可以作為EGFR-TKI固有耐藥的NSCLC患者預后和治療的候選生物標志物。
參考文獻：
Wang Y, Wei J, Feng L, Li O, Huang L, Zhou S, Xu Y, An K, Zhang Y, Chen R, He L, Wang Q, Wang H, Du Y, Liu R, Huang C, Zhang X, Yang YG, Kan Q, Tian X. Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Mol Cancer. 2023 May 9;22(1):81.
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