多肽從頭測序de novo Sequencing技術詳解
多肽從頭測序（de novo sequencing）是指在不借助序列數據庫的情況下，通過串聯質譜(MS/MS)得到多肽氨基酸序列的分析過程。這與另一種流行的肽段鑒定方法--“數據庫搜索”形成了鮮明對比，即在給定的數據庫中搜索以找到目標肽。從頭測序的一個明顯優勢是它既適用于數據庫搜索，也適用于新肽。
01 | 基本原理
在串聯質譜中，質譜通過對肽鏈碎裂產生的碎片離子檢測，進而產生ms/ms譜。根據所采用的碎裂方法，可以產生不同的碎片離子類型。目前應用最廣泛的碎裂方法是碰撞誘導解離(CID)和電子轉移解離(ETD)，CID主要產生b和y離子，ETD主要產生c和z離子。
圖1. 在CID碎裂的MS/MS 譜圖中，相同肽段的多個拷貝沿著肽骨架碎裂成為b、y離子。產生的譜圖由以橫坐標為m/z (質荷比)的峰構成，其值由碎片離子的響應構成。高質量的譜圖通常包含了許多（但不一定是全部）的理論碎片離子。
de novo sequencing的主要思路是用兩個碎片離子之間的質量差值來計算肽主鏈上氨基酸殘基的質量。質量數通常可以獨特地確定殘基的類型。例如，在圖1中y7和y6的質量差值為129，即E的殘基質量數。同理，下一個相鄰的殘基，可以通過y6和y5之間的質量差確定為L。該解譜過程會進行下去，直到所有的氨基酸殘基都被確定。
因此，如果能在譜圖中識別出y離子或b離子序列，就可以確定肽的序列。然而，質譜儀獲得的譜圖并不能告訴我們峰的離子類型，這需要專家或計算機算法在從頭測序過程中計算出來。一些因素會給這一過程帶來困難，比如：
因此，如果能在譜圖中識別出y離子或b離子序列，就可以確定肽的序列。然而，質譜儀獲得的譜圖并不能告訴我們峰的離子類型，這需要專家或計算機算法在從頭測序過程中計算出來。一些因素會給這一過程帶來困難，比如：
- 不正確的b、y離子分配
- 一些離子碎片的缺失（比如圖1中的 b1、y8)
- 譜圖中其他碎片離子類型（比如圖1中的 b3-NH3）
- 譜圖中存在噪音峰
- 高度相似的氨基酸殘基質量數(I=L and K=Q)
- 殘基上的PTM(翻譯后修飾)可能導致質量模糊，并使肽碎片類型復雜化
以上這些因素，可能導致de novo測序只能從譜圖中計算出部分正確的序列標簽
02 | 自動化的de novo測序
手動進行de novo測序的解譜工作要求人員的專業性，并且十分地費時。一個可靠的自動化de novo測序解決方案可以節省寶貴的人工時間，并大大降低了實驗室的人工成本。自動化de novo測序在生物信息學領域得到了廣泛的研究，并開發了多種算法，雖然計算機算法所使用的基本原理與人工de novo測序相同，但計算機算法的執行過程通常與人工分析不盡相同。
PEAKS Studio軟件于2002年首次發布，目前已成為自動化從頭測序的行業標準軟件，并以其準確性、快速分析的能力，以及用戶友好性而聞名。
02 | 自動化的de novo測序
手動進行de novo測序的解譜工作要求人員的專業性，并且十分地費時。一個可靠的自動化de novo測序解決方案可以節省寶貴的人工時間，并大大降低了實驗室的人工成本。自動化de novo測序在生物信息學領域得到了廣泛的研究，并開發了多種算法，雖然計算機算法所使用的基本原理與人工de novo測序相同，但計算機算法的執行過程通常與人工分析不盡相同。
PEAKS Studio軟件于2002年首次發布，目前已成為自動化從頭測序的行業標準軟件，并以其準確性、快速分析的能力，以及用戶友好性而聞名。
03 | 結合數據庫搜索使用
過去，人們常認為de novo測序分析的速度非常慢。因此，只有在蛋白質數據庫不可用的情況下，才使用de novo測序的方法。然而，隨著計算機算法(如PEAKS)的最新發展，速度已不再是問題。這使得在蛋白質組學研究中對得到的每一張質譜圖都進行de novo測序成為一種可行的選擇。即使是當數據庫可用的情況下，de novo測序也可以通過以下方式幫助多肽的鑒定。
1. de novo測序肽段與數據庫搜索肽段之間的匹配或相似度可以很好地說明數據庫搜索結果的正確性。因此，從頭測序可用于提高數據庫搜索性能。
2. de novo測序得到的肽段如果在數據庫中沒有顯著匹配，可能是在樣品中存在全新的肽段，值得進一步確定，有可能發現預期外的PTM或者多肽的突變。
如下圖2所示，PEAKS Studio軟件在設置標準操作流程的時候，已經考慮到了這個問題。
1. de novo測序肽段與數據庫搜索肽段之間的匹配或相似度可以很好地說明數據庫搜索結果的正確性。因此，從頭測序可用于提高數據庫搜索性能。
2. de novo測序得到的肽段如果在數據庫中沒有顯著匹配，可能是在樣品中存在全新的肽段，值得進一步確定，有可能發現預期外的PTM或者多肽的突變。
如下圖2所示，PEAKS Studio軟件在設置標準操作流程的時候，已經考慮到了這個問題。
圖2. 充分利用de novo測序 的標準PEAKS Studio工作流程
參考文獻1.Tran NH, Qiao R, Xin L, Chen X, Liu C, Zhang X, Shan B, Ghodsi A, Li M. Deep learning enables de novo peptide sequencing from data-independent-acquisition mass spectrometry. Nature Methods. 16(1), 63-66. 20/12/2018.
2.Hughes, C., Ma, B., Lajoie, G.A. De novo Sequencing Methods in Proteomics. Methods Mol Biol. 2010;604:105-21.
3.Ma, B. & Johnson, R. De novo Sequencing and Homology Searching. Molecular & Cellular Proteomics. 2012;11(2).
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