1、前言

逆轉錄是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導下的DNA合成。在逆轉錄過程中必不可少的逆轉錄酶，除了其依賴RNA的DNA聚合酶活性，還需要鎂離子或錳離子等輔助因子，同時包括依賴于DNA的DNA聚合酶活性和RNase H活性，它可以降解DNA與RNA雜交鏈中的RNA鏈。與典型的DNA聚合酶不同，逆轉錄酶缺乏校對功能，在PCR實驗中逆轉錄酶存在抑制Taq聚合酶活性的功能，進而導致不準確的測定結果。
 

目前，最常用的逆轉錄酶類型有兩種，一是來自禽類成髓細胞瘤病毒（AMV）的逆轉錄酶，二是來自莫洛尼小鼠白血病病毒（M-MLV）的逆轉錄酶。AMV逆轉錄酶相對于其他類型的逆轉錄酶，它更具有加工性，具有更高的最佳活性溫度范圍（42~48°C），更適合逆轉錄具有較強二級結構的RNA。然而，AMV逆轉錄酶具有相對較高的RNase H活性，這使其在合成長轉錄本方面的作用較小。相比之下，M-MLV 逆轉錄酶是由一個單一的亞基組成，具有較低的RNase H活性，由于這些特性，M-MLV RT經常被用于較長的轉錄本。M-MLV逆轉錄酶最適活性溫度為37°C。許多M-MLV變體是可用的，包括RNase H點突變體，它們更耐熱，更適合復雜困難的模板。
 

2、工作流程和用途

逆轉錄可用于生成適合各種下游應用的cDNA。

▲ 圖1 RNA工作流程
 

在某些情況下，逆轉錄和實時熒光定量PCR在一個單一的反應混合液中反應時，稱為一步法RT-qPCR。當逆轉錄和實時PCR在不同的反應混合液中發生時，被稱為兩步法RT-qPCR。
 

▲ 圖2 兩步法RT-qPCR工作流程
 

當需要大量cDNA通過PCR或qPCR研究多個轉錄本時，兩步法是首選。在一步法RT-qPCR中，目標序列在同一反應孔或容器中進行逆轉錄和qPCR擴增。用隨機引物或oligo（dT）引物代替目標特異性引物。一步法RT-qPCR相對于兩步法RT-qPCR需要的樣本更少。此外，任何技術重復之間的方差都可以用來評估這兩個酶促步驟的聯合可變性。一步法RT- qPCR經常被用于RNA的定量和質量控制。一步法可能的劣勢在于引物設計更復雜，因為引物必須在逆轉錄和PCR溫度下同時發揮作用。

3、考量點

理想情況下，每一個靶向轉錄的RNA或mRNA分子都將轉化為一個cDNA分子，即所有的靶RNA都將以相同的效率轉錄。然而，RT效率的可變性，無論是由于RNA樣本質量、引物設計、RT酶的選擇，還是其他因素，都會影響所產生的代表RNA分子在樣本中的分布程度的cDNA。RT效率的變化是在RT-qPCR反應總體結果質量中一個被嚴重低估的因素，其影響已延伸到大量已發表的基因表達研究。MIQE指南中概述的如樣本、核酸提取和逆轉錄細節，均是為了可以獲得有效的RT-qPCR結果。成功的逆轉錄考量參數有以下幾點：

RNA純化和純度：

在選擇RNA提取方法時，需要考慮許多參數，但理想情況下，RNA樣本應該不受污染蛋白質，如核酸酶，這可能會干擾cDNA合成和下游應用。產量是一個主要的考慮因素，然而，有效地去除基因組DNA（gDNA）同樣重要。即使是少量的gDNA污染也會導致qPCR結果的可變性，而大量的gDNA污染也會導致直接的定量錯誤。減少對gDNA污染一種方法是在RNA分離方法中加入一個DNase酶消化的步驟。此外，應使用無逆轉錄酶對照（無RT）來確定RNA樣本中是否存在gDNA。

RNA完整性：

RNA樣本的完整性對于許多下游應用都是至關重要的。完整的真核生物的RNA一個重要特征是同時存在28S和18S核糖體RNA（rRNA）（圖3）。這些條帶的存在和整體RNA質量可以通過瓊脂糖凝膠電泳和其他方法來評估。理想情況下，在瓊脂糖凝膠上顯示時，28S帶的亮度應該是18S帶的兩倍，盡管大致相等的亮度也可以表明RNA在大多數應用中具有足夠高的質量。
 

▲ 圖3：RNA完整性電泳圖，RNA降解導致拖帶現象
 

逆轉錄引物：

cDNA合成通常涉及使用三種引物中的一種：Oligo（dT）引物、隨機引物（Random primer）或基因特異性引物。隨機引物是一種隨機序列的短寡核苷酸，對于長（>4kb）或缺乏poly (A)尾巴的轉錄本，如原核mRNA的情況，它們可以在轉錄本的多個點上啟動逆轉錄，因此，它們對于長mRNA和具有重要二級結構的轉錄本很有用。通常使用隨機六聚體引物，使用隨機八或九聚體引物可以促進更長的cDNA合成，因為它們雜交的頻率較低。基因特異性引物通常用于一步（偶聯）RT-PCR。這些方法通過將所有逆轉錄酶活性引導到特定的信息，而不是轉錄整個RNA來提高敏感性。對于目標擴增子長度約為100bp或以下的RT-qPCR應用，使用更高濃度的隨機引物可能是有利的。設計跨越內含子或內含子-外顯子邊界的引物可以確保cDNA是由剪接的mRNA序列合成的，而不是gDNA中的親本基因序列合成。經過生物素修飾或在5‘端添加序列標簽等修飾的引物可用于純化和/或分析由特定義或反義模板鏈合成的cDNA。
 

RNA的二級結構：

RNA分子具有影響逆轉錄的二級結構，而高GC含量會降低逆轉錄效率。在逆轉錄或cDNA合成前高溫變性處理，可能有利于困難模板的逆轉錄。RNA可以通過在65°C下變性5分鐘來打開其二級結構。
 

cDNA的qPCR定量：

強烈建議在cDNA合成后進行RT酶的熱失活處理。RT酶失活后，要么直接通過qPCR對cDNA進行目標特異性的定量分析，要么將滅活的反應液冷凍保存，直到需要時才使用。qPCR反應混合物通常可容納cDNA樣本體積的增加，最高可占總反應體積的20%。cDNA可以作為未稀釋的逆轉錄反應產物直接添加到qPCR中，也可以稀釋后進行qPCR反應。cDNA的定量是RT-qPCR工作流程成功的關鍵。一般來說，作為模板的cDNA的量不應超過投入100ng總RNA逆轉錄后所得的量。由高度豐富的轉錄本產生的cDNA可以在不到1pg的總RNA中檢測到。
 

4、總結

逆轉錄是RT-qPCR和其他廣泛應用的關鍵步驟，我們必須仔細考慮RNA模板質量和實驗設計細節，并清楚了解RT效率和RT偏差程度等性能特征。MIQE指南提供了一個實驗設計細節框架，遵循相應準則可以獲得有效且準確的RT-qPCR結果。