微生物組測序應用:早產兒出生后不同時間點腸道微生物定植的動態變化
2023年02月17日，中國農業科學院深圳農業基因組研究所Adnan Khan、云南省第一人民醫院米弘瑛為共同第一作者，中山大學附屬第六醫院郝虎/李思濤、南方醫科大學附屬佛山市婦幼保健院戴怡蘅為論文共同通訊作者在《Front Microbiol》雜志以“Dynamic changes of the gut microbial colonization in preterm infants with different time points after birth”為題發表研究論文。該研究通過微生物組學的16s RNA等實驗揭示了12名早產兒在出生后第1、7、14、21、28、42天六個時間點（C1、C2、C3、C4、C5、C6）腸道微生物定植過程中的動態變化，為早產兒在出生后不同時間點針對性細菌治療提供新的視角。深圳易基因科技為本研究提供微生物組測序分析服務。
標題：Dynamic changes of the gut microbial colonization in preterm infants with different time points after birth 早產兒出生后不同時間點腸道微生物定植的動態變化
時間：2023-02-17
期刊：Frontiers in Microbiology
影響因子：IF 6.064
技術平臺：16S rRNA等
摘要：
與早產相關的風險在所有妊娠中分布不均衡。在孕早期，壞死性小腸結腸炎（NEC）和晚發性敗血癥（LOS）等并發癥更為常見，且與腸道微生物組組成變化相關。常規細菌培養技術表明，早產兒腸道微生物組的定殖與健康足月兒的腸道微生物組定殖有顯著差異。本研究旨在分析早產兒在不同時間點（出生后第1、7、14、21、28、42 天）糞便微生物組的動態變化。研究招募了2017年1月至2017年12月在中山大學附屬第六醫院住院的12名早產兒，利用16S rRNA基因測序分析對130份早產兒糞便樣本進行分析。研究結果表明早產兒糞便微生物群的定植過程在出生后的不同時間點呈高度動態變化，即Exiguobacterium、Acinetobacter和Citrobacter隨著年齡增長表現出豐度下降模式，而在42天的早產兒糞便微生物群發育過程中，腸球菌（克雷伯氏菌和大腸桿菌）菌群逐漸生長成為主要微生物群。而早產兒腸道雙歧桿菌的定植相對較晚，并沒有迅速成為主要的微生物群。此外，研究結果還表明Chryseobacterium菌群的存在，且在不同時間點的定殖不同。本研究為早產兒出生后不同時間點針對性細菌治療提供新的視角。
材料和方法：
表1：12例早產兒的一般臨床數據
圖1：研究流程圖
實驗結果
（1）早產兒微生物群落組成的綜合表征
研究人員使用來自12名早產兒出生后多個時間點（C1-C6）的130份糞便樣品的16S rRNA基因數據來評估微生物多樣性的時間相關變化，鑒定不同時間點微生物組中的最大豐度和富集驅動因子，并分析糞便微生物在早產兒健康發育過程中的表型和功能。
圖2：早產兒6個時間點腸道微生物類群相對豐度的比較。
（2）早產兒出生后不同時間點腸道菌群中豐度最高的屬（genera）
對豐度最高的屬分析與β多樣性分析結果一致，表明豐度最高的屬多樣性隨時間推移而增加。結果表明豐度最高的屬（Exiguobacterium、Prevotella、Acinetobacter、Pseudomonas、Enterococcus、Bifidobacterium、Escherichia-Shigella、Klebsiella、Gardnerella、Streptococcus和Chryseobacterium）發生了時間依賴性變化，且在各組區系結構中的樣本異質性增加。圖3A顯示了不同時間點組中前40個豐度最高的屬，其中一半為所有時間點組間共有（圖3B）。圖3C中的熱圖通過聚類分析表明，C1-C3中的糞便微生物群由Exiguobacterium、Pseudomonas、Lactococcus、Brevundimonas、Burkholderiaceae和Thermus組成；C3-C5中為Enterococcus富集區，在C6中為Escherichia−Shigella富集區。
圖3：豐度最高的腸道微生物屬在早產兒6個不同時間點組中富集情況。
（3）早產兒6個時間點腸道微生物組的差異分類
為進一步表征六個時間點組間腸道微生物群的動態變化，本研究在不同的分類水平上對這些分類群的系統發育變化進行時間點依賴性分布分析，即：屬、門、綱、目、科、種。
圖4：在早產兒的六個時間點組中富集的顯著差異分類群。
A-F. 早產兒不同時間點腸道優勢微生物屬（genus）水平的動態變化。
（4）早產兒年齡依賴性腸道微生物群網絡及其關鍵驅動屬
研究人員利用稀疏成分相關性（SparCC）分析來研究所有時間依賴性樣品中腸道微生物之間的相互作用。所有相對豐度≥0.1%的屬都包含在網絡中。Exiguobacterium（Firmicutes）網絡與不動桿菌（Proteobacteria）、假單胞菌（Proteobacteria）和乳球菌（Firmicutes）的相關性最強。同樣，Serratia（Proteobacteria）也與Veillonella（Firmicutes）呈現出強相關性。但Streptococcus、Staphylococcus、Enterococcus、Bacillus (Firmicutes)與其他屬的相關性最弱。前12個顯著差異屬的熱圖和層次聚類分析表明了樣本的相關性（|FC|>1、p<0.05）。
圖5：早產兒年齡依賴性腸道微生物群網絡及其關鍵驅動屬
（5）基于分類組成預測微生物代謝功能
為更好了解早產兒腸道微生物組、疾病易感性和細菌代謝的功能差異，研究人員利用PICRUSt通過分析生成的OUT及其參考基因組數據庫的16S rRNA數據中的基因，來預測細菌宏基因組的基因家族。結果表明，在早產兒C1、C2、C3、C5和C6組中，分別有63個、1個、5個、22個和24個KEGG通路顯著過表達。C1、C2、C3和C5組中鑒定的大多數通路為維持生命所必需，包括ABC轉運蛋白、核苷酸代謝、抗壞血酸、醛酸鹽代謝、碳水化合物、蛋白質代謝二惡英降解和脂質代謝。描述代謝過程和免疫狀態的許多通路在所有組中均過度表達（over-represented，即富集enriched）。所有這些通路對于影響微生物在環境中的分布、存活和增殖至關重要，結果還需要使用宏基因組學來進一步證實。
圖6：早產兒出生后6個時間點（C1、C2、C3、C5、C6）的組間功能模塊相對豐度比較，使用從PICRUSt生成的線性判別分析效應量（LEfSe）分析。35個、1個、5個、18個和15個KEGG通路分別在C1、C2、C3、C4和C6中顯著富集。數據顯示，所有組間預測的細菌代謝功能存在差異。LDA評分>2.5表示具有顯著差異的通路。
結論：
本研究結果將有助于更好地了解早產兒出生后腸道微生物群變化對健康的長期影響，本研究首次對出生42日齡以內的早產兒糞便微生物組組成進行研究。結果表明早產兒糞便微生物群在出生后一天左右較為簡單，Exiguobacterium、Acinetobacter和Citrobacter占整個微生物群的83%。隨著時間的推移，這三個主要細菌家族的相對豐度下降，而Enterococcus、Klebsiella、Escherichia菌群逐漸增加，并成為主要菌群，其中任何一種細菌都可能引起消化道感染。同時，早產兒腸道雙歧桿菌的定植相對較晚，并沒有迅速成為主要的微生物群。而新生兒重癥監護室早產兒的糞便微生物群中存在Chrysobacterium菌群，表明其健康存在額外風險。本研究旨在為比較和理解早產兒腸道微生物群的時間依賴性動態變化開辟新的可能性，
并為早產兒在出生后不同時間點針對性細菌治療提供新的視角。
參考文獻：https://www.pmop.cn/pubmed/36876108
標題：Dynamic changes of the gut microbial colonization in preterm infants with different time points after birth 早產兒出生后不同時間點腸道微生物定植的動態變化
時間：2023-02-17
期刊：Frontiers in Microbiology
影響因子：IF 6.064
技術平臺：16S rRNA等
摘要：
與早產相關的風險在所有妊娠中分布不均衡。在孕早期，壞死性小腸結腸炎（NEC）和晚發性敗血癥（LOS）等并發癥更為常見，且與腸道微生物組組成變化相關。常規細菌培養技術表明，早產兒腸道微生物組的定殖與健康足月兒的腸道微生物組定殖有顯著差異。本研究旨在分析早產兒在不同時間點（出生后第1、7、14、21、28、42 天）糞便微生物組的動態變化。研究招募了2017年1月至2017年12月在中山大學附屬第六醫院住院的12名早產兒，利用16S rRNA基因測序分析對130份早產兒糞便樣本進行分析。研究結果表明早產兒糞便微生物群的定植過程在出生后的不同時間點呈高度動態變化，即Exiguobacterium、Acinetobacter和Citrobacter隨著年齡增長表現出豐度下降模式，而在42天的早產兒糞便微生物群發育過程中，腸球菌（克雷伯氏菌和大腸桿菌）菌群逐漸生長成為主要微生物群。而早產兒腸道雙歧桿菌的定植相對較晚，并沒有迅速成為主要的微生物群。此外，研究結果還表明Chryseobacterium菌群的存在，且在不同時間點的定殖不同。本研究為早產兒出生后不同時間點針對性細菌治療提供新的視角。
材料和方法：
表1：12例早產兒的一般臨床數據圖1：研究流程圖
- 選擇實驗組以鑒定組間微生物群的差異
- 標準化技術因素和樣品處理，以控制過程的每個步驟引入的變化。從臨床變量到樣本處理，收集和管理每個樣本各個方面的metadata做數據分析。
實驗結果
（1）早產兒微生物群落組成的綜合表征
研究人員使用來自12名早產兒出生后多個時間點（C1-C6）的130份糞便樣品的16S rRNA基因數據來評估微生物多樣性的時間相關變化，鑒定不同時間點微生物組中的最大豐度和富集驅動因子，并分析糞便微生物在早產兒健康發育過程中的表型和功能。
圖2：早產兒6個時間點腸道微生物類群相對豐度的比較。
- 從門（Phyla）水平上分析6個時間點腸道微生物群的組成。
- 組間（C1–C6）的F/P比值箱形圖。
- 六個時間點組間腸道微生物門（Phyla）的重疊分析Venn圖。包括在六個以上的糞便樣本中檢測到的門。
- 使用Shannon指數分析六組細菌群落的α多樣性和豐度。
- 使用Bray–Curtis差異的NMDS進行Beta（β）多樣性分析。
- 不同時間點組間腸道微生物群的未加權Unifrac距離（Unweighted Unifrac distance）。使用非參數Kruskal–Wallis檢驗和Tukey檢驗計算成對p值：*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001為具有顯著性。
（2）早產兒出生后不同時間點腸道菌群中豐度最高的屬（genera）
對豐度最高的屬分析與β多樣性分析結果一致，表明豐度最高的屬多樣性隨時間推移而增加。結果表明豐度最高的屬（Exiguobacterium、Prevotella、Acinetobacter、Pseudomonas、Enterococcus、Bifidobacterium、Escherichia-Shigella、Klebsiella、Gardnerella、Streptococcus和Chryseobacterium）發生了時間依賴性變化，且在各組區系結構中的樣本異質性增加。圖3A顯示了不同時間點組中前40個豐度最高的屬，其中一半為所有時間點組間共有（圖3B）。圖3C中的熱圖通過聚類分析表明，C1-C3中的糞便微生物群由Exiguobacterium、Pseudomonas、Lactococcus、Brevundimonas、Burkholderiaceae和Thermus組成；C3-C5中為Enterococcus富集區，在C6中為Escherichia−Shigella富集區。
圖3：豐度最高的腸道微生物屬在早產兒6個不同時間點組中富集情況。
- 6個時間點（C1-C6）內豐度最高的前40個屬
- 6個不同時間點組間腸道微生物屬的重疊分析Venn圖。
- 6個時間點組間腸道微生物群中差異表達最顯著的屬。名稱前面的單個字母（g、f和c）分別表示屬、門和綱。
（3）早產兒6個時間點腸道微生物組的差異分類
為進一步表征六個時間點組間腸道微生物群的動態變化，本研究在不同的分類水平上對這些分類群的系統發育變化進行時間點依賴性分布分析，即：屬、門、綱、目、科、種。
圖4：在早產兒的六個時間點組中富集的顯著差異分類群。
A-F. 早產兒不同時間點腸道優勢微生物屬（genus）水平的動態變化。
- 從門到屬水平的顯著差異分類群系統發育分支圖。微生物類用字母表示。每個節點表示不同分類級別的一個分類單元。節點顏色是在相關隊列（C1-C6）中觀察到的豐度較高的分類群。
- 具有顯著差異的物種LDA得分大于預估值；默認分數為2.5。直方圖長度表示LDA分數；表示不同群體之間具有存在顯著差異的物種影響影響程度。
（4）早產兒年齡依賴性腸道微生物群網絡及其關鍵驅動屬
研究人員利用稀疏成分相關性（SparCC）分析來研究所有時間依賴性樣品中腸道微生物之間的相互作用。所有相對豐度≥0.1%的屬都包含在網絡中。Exiguobacterium（Firmicutes）網絡與不動桿菌（Proteobacteria）、假單胞菌（Proteobacteria）和乳球菌（Firmicutes）的相關性最強。同樣，Serratia（Proteobacteria）也與Veillonella（Firmicutes）呈現出強相關性。但Streptococcus、Staphylococcus、Enterococcus、Bacillus (Firmicutes)與其他屬的相關性最弱。前12個顯著差異屬的熱圖和層次聚類分析表明了樣本的相關性（|FC|>1、p<0.05）。
圖5：早產兒年齡依賴性腸道微生物群網絡及其關鍵驅動屬
- 根據SparCC結果構建早產兒的微生物交互網絡，并使用Cytoscape進行可視化。（C1）出生后第1天、（C2）出生后第7天、（C3）出生后第14 天、（C4）出生后第21天、（C5）出生后第28天、（C6）出生后第42天。網絡包含平均豐度>0.1%的屬、相關性|R|>0.2和p<0.05，節點顏色表示屬的門，節點大小表示加權節點連接，邊緣顏色和厚度表示相關性。
- 所有時間依賴性樣本（C1–C6）中前12個顯著差異的微生物屬熱圖。紅色對應于上調的基因產物，綠色對應于下調的基因產物。行表示每個差異表達的門，列表示每個樣本
（5）基于分類組成預測微生物代謝功能
為更好了解早產兒腸道微生物組、疾病易感性和細菌代謝的功能差異，研究人員利用PICRUSt通過分析生成的OUT及其參考基因組數據庫的16S rRNA數據中的基因，來預測細菌宏基因組的基因家族。結果表明，在早產兒C1、C2、C3、C5和C6組中，分別有63個、1個、5個、22個和24個KEGG通路顯著過表達。C1、C2、C3和C5組中鑒定的大多數通路為維持生命所必需，包括ABC轉運蛋白、核苷酸代謝、抗壞血酸、醛酸鹽代謝、碳水化合物、蛋白質代謝二惡英降解和脂質代謝。描述代謝過程和免疫狀態的許多通路在所有組中均過度表達（over-represented，即富集enriched）。所有這些通路對于影響微生物在環境中的分布、存活和增殖至關重要，結果還需要使用宏基因組學來進一步證實。
圖6：早產兒出生后6個時間點（C1、C2、C3、C5、C6）的組間功能模塊相對豐度比較，使用從PICRUSt生成的線性判別分析效應量（LEfSe）分析。35個、1個、5個、18個和15個KEGG通路分別在C1、C2、C3、C4和C6中顯著富集。數據顯示，所有組間預測的細菌代謝功能存在差異。LDA評分>2.5表示具有顯著差異的通路。
結論：
本研究結果將有助于更好地了解早產兒出生后腸道微生物群變化對健康的長期影響，本研究首次對出生42日齡以內的早產兒糞便微生物組組成進行研究。結果表明早產兒糞便微生物群在出生后一天左右較為簡單，Exiguobacterium、Acinetobacter和Citrobacter占整個微生物群的83%。隨著時間的推移，這三個主要細菌家族的相對豐度下降，而Enterococcus、Klebsiella、Escherichia菌群逐漸增加，并成為主要菌群，其中任何一種細菌都可能引起消化道感染。同時，早產兒腸道雙歧桿菌的定植相對較晚，并沒有迅速成為主要的微生物群。而新生兒重癥監護室早產兒的糞便微生物群中存在Chrysobacterium菌群，表明其健康存在額外風險。本研究旨在為比較和理解早產兒腸道微生物群的時間依賴性動態變化開辟新的可能性，
并為早產兒在出生后不同時間點針對性細菌治療提供新的視角。
參考文獻：https://www.pmop.cn/pubmed/36876108
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