子宮內膜是子宮的黏膜內層，它在整個生殖生命周期中經歷脫落、再生和分化的動態、周期性變化。子宮內膜功能異常常引發許多疾病（包括異常子宮出血、不孕癥、流產、先兆子癇、子宮內膜異位癥和子宮內膜癌），這些疾病極大的影響了女性健康。因此，繪制人類子宮內膜時空動態圖譜、研究人類月經周期中調節細胞分化的機制顯得尤為重要。

       2022年1月，來自英國劍橋大學的研究人員們在國際權威期刊Nature genetics上發表了題為 mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro 的研究論文，該文利用了10 x Genomics 公司的高通量scRNA-seq和Visium空間基因表達解決方案，繪制了人子宮內膜細胞的時空圖譜，為后續人類攻克子宮內膜異位癥以及子宮內膜癌等子宮內膜相關疾病奠定了堅實的理論基礎。


文章結果

1. 人類子宮的全層單細胞圖譜

      為了生成人類子宮內膜細胞的時空圖譜，研究者通過使用10x Genomics的單細胞轉錄組學和空間轉錄組學方法（Visium）來分析所有的子宮樣本。來自 15 個個體的 98,568 個細胞進行降維聚類分析后得到14個簇，并分成五種主要的細胞類型。來自另外四個增殖期子宮內膜全層樣本的 snRNA-seq 數據證實了在增殖期發現的細胞群體。同時研究者使用 Visium 空間轉錄組測序技術檢測了兩個個體的增殖期和分泌期的四個全層子宮樣本。
       整合單細胞和空間轉錄組測序數據后，研究者發現PVSTEAP4僅存在于子宮內膜中，而成纖維細胞 C7 在增殖期和分泌期都富含于子宮內膜的基底層中。總之，本研究得到了子宮的全層單細胞圖譜及其在子宮內膜和子宮肌層中的細胞位置的綜合圖譜。

2. 子宮內膜上皮細胞的時空圖譜

       子宮內膜上皮細胞可被分為兩個譜系，即分泌型和纖毛型。上皮細胞根據其標志物表達分為四個主要群體：（1）SOX9 細胞群 (2)纖毛細胞(3) 管腔細胞 (4) 腺細胞 ；scRNA-seq 可將SOX9細胞群細分為三個細胞亞群。通過整合 scRNA-seq 和 Visium 數據，研究者定義了SOX9 三個子亞群的空間信息，利用RNA scope 探針做的單分子熒光原位雜交實驗（smFISH）驗證了 Visium 數據。


3 子宮內膜疾病中的 SOX9+ 上皮細胞 

      利用TCGA 數據庫中的bulk RNA 測序數據，研究者發現SOX9+上皮細胞群在腫瘤中占主導地位。基于上皮細胞中的表達信號，子宮內膜腺癌被分為了三種模式，子宮內膜腺癌的晚期階段（III 期和 IV 期）具有更強的SOX9+LGR5+信號。
       總之，本研究分析表明功能失調的上皮細胞是子宮內膜疾病的主要驅動因素。 通過分析兩個 SOX9 細胞群體的轉錄組，我們得到在子宮內膜癌和子宮內膜異位癥中占主導地位的特定細胞信號。

4、微環境對上皮細胞分化的影響

       通過分析整個月經周期中調節上皮細胞分化的轉錄因子及其靶基因的表達，結果表明 NOTCH 和 WNT 通路在調節分泌和纖毛細胞譜系分化中的不同作用。參與 WNT 通路的基因FOXJ1和LGR5在腔表面高度表達，而NOTCH2在功能層的腺體中富集。研究者進一步使用免疫組織化學結合 smFISH 實驗對結果進行了驗證。
       研究者開發了 CellPhoneDB v.3.0，該升級版本在映射配體-受體對時會考慮空間細胞共定位。根據單細胞和空間的聯合分析確定了三個以上皮細胞為中心的子宮內膜微環境，在每個微環境上運行 CellPhoneDB，發現顯著的上皮-基質相互作用。此外，蛻膜基質細胞表達的DKK1（WNT通路的抑制劑）顯著高于非蛻膜基質細胞，在空間轉錄組學中也發現了圍繞分泌內皮腺體的DKK1的表達。總之，這些發現表明 WNT 信號是在分泌細胞譜系中被抑制，NOTCH信號將占主導地位。


5、子宮內膜類器官對卵巢激素的反應

       研究者進一步通過在單細胞水平上分析子宮內膜類器官來檢測 WNT 和 NOTCH 信號通路在體外對子宮內膜上皮細胞的潛在作用。通過單細胞實驗數據證實類器官對激素的反應與體內相似，卵巢激素在體內和體外都激活了相似的途徑。為了測試 WNT 和 NOTCH 通路在纖毛和分泌細胞分化中的作用，研究者在 NOTCH 或 WNT 抑制劑存在的情況下培養類器官，使用組織學和單細胞轉錄組學來分析表明，在 NOTCH 抑制劑存在下，有較高比例的纖毛細胞和較低比例的分泌細胞。當 WNT 被抑制時纖毛細胞幾乎不存在，分泌細胞的比例增加。

總結

       本文生成了人類子宮的單細胞和空間細胞圖譜以及子宮內膜類器官，這些將提高對常見疾病（包括不孕癥、子宮內膜異位癥和子宮內膜癌）中發生的分子和細胞異常的理解。本文剖析了決定管腔和腺體微環境中上皮細胞的信號通路，揭示了在體內和體外調節分泌和纖毛細胞分化的途徑。WNT 或 NOTCH 通路的體外下調分別增加了分泌和纖毛細胞的分化效率。研究人員利用這個細胞圖譜來解讀了來自子宮內膜癌和子宮內膜病變的群體數據，闡明了這些疾病中占主導地位的細胞類型。這些結論為未來開發包括子宮內膜異位癥和子宮內膜癌等常見疾病的治療方法提供了一個理論支持。


參考文獻：
Garcia-Alonso, Luz, et al. “Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and invitro.” Nature Genetics 53.12 (2021): 1698-1711.

     
附：子宮內膜組織解離原理

      在組織樣本離體后24h內進行組織解離 ，進行兩步酶消化處理；首先用膠原酶處理子宮內膜組織以回收基質部分，隨后經過濾把保留在 100 μm 過濾器上的組織片用胰蛋白酶處理以富集上皮部分。

詳細實驗步驟如下：
一. 用膠原酶解離子宮內膜
1. 配制混合膠原酶液。
2. 刮掉組織上殘存的血管。注意：如果供體被灌注，我們可以跳過這一步。
3. 用 PBS 清洗組織{可選}。
4. 將濕紙巾放在培養皿下，取 2 把手術刀，將組織大致切碎。
5. 將切碎的組織轉移到含有膠原酶混合物的 50 mL裂解管中（~ 3 毫升/組織，取決于組織的大小）。
6. 擰緊蓋子，然后用封口膜密封。
7. 在 37 °C 下孵育45min ，孵育中要搖勻組織。
8. 用 20 mL 10%的RPMI 重懸組織。
9. 使用小孔過濾器 (100um) 過濾樣品——不要丟棄濾膜上殘留的組織，殘留的組織將用于“子宮內膜-胰蛋白酶”方案。
10. 已過濾得到的樣品以 450 g 離心5min。
11. 用 10 mL 的 PBS 洗滌兩次。
12. 用 1 mL RPMI 10% 重懸細胞，計數細胞并分選細胞群（請參閱流式細胞術和分選的“細胞”染色方案)。


二、接下來對濾膜上殘存的組織進行-胰蛋白酶處理
1. 配制胰蛋白酶處理混合液。
2 .按照“用膠原酶解離子宮內膜”方案的第 9步，將組織碎片保留在細胞過濾器上。通過將過濾器倒置到新的 50 mL 管中并用 1 mL 移液器加入 45 mL PBS溶液 來收集保留在過濾器上的碎片。
3.與上一步膠原酶處理后得到的樣品混合在一起后，以 450 g 離心5min，棄去上清液。
4. 用 10 mL 0.25% 的胰蛋白酶/EDTA溶液重懸碎片，并在 37 °C 下搖動孵育20min 。
5. 加入 20 mL含 10% FBS 的 RPMI。
6. 緩慢且小心地將樣品通過 100 μM 的濾膜（此時是非常稠密的液體），丟棄濾膜上殘留的組織。
7. 在 4℃下，以 500 rcf 離心5min，棄去上清液。
8 .{可選} 用 5 mL的 RLB 混合物重懸樣品并孵育 10min。
 *RLB溶液的制備：用水稀釋 10x RLB 原液 ；RBC 裂解后，加入 10 mL 1 的 PBS 并以 500 rcf 離心 5min；
9. 用 1 mL PBS溶液 重懸細胞。
10. 在 4℃下，以 500 rcf 離心5min，棄去上清液。
11. 用 250 μL的 PBS 重懸細胞（最終體積取決于細胞數）
12. 使用細胞過濾器過濾細胞。
13. 使用臺盼藍和血細胞計數器計數活細胞。