導讀

韓牛（Bos taurus coreanae）是一種馴化的哺乳動物，在韓國消費市場作為食物資源，其牛肉消費量遠超其他品種，這種消費模式導致了區分韓牛和其他牛品種的分子研究的出現。不僅是牛，其他經濟動物的不同品種在市場中的經濟價值也存在較大的差異，所以準確進行種質鑒定勢在必行。

在之前的一項研究中，使用傳統的PCR方法和Sanger測序驗證確定了由TE關聯缺失事件產生的韓牛特異性SV。它可以用作區分不同牛品種的分子標記（即韓牛與荷斯坦牛）。然而，PCR存在缺陷，每個樣品都有各種最終拷貝定量。為了克服傳統PCR的局限性，并準確評估先前研究中確定的韓牛特異性SV位點，檀國大學生物醫學科學系聯合畜牧研究所和檀國大學醫學院，使用naica️®微滴芯片數字PCR系統對韓牛特異性SV位點進行了更為精確的檢測，并將成果《Quantitative evaluation of the molecular marker using droplet digital PCR》發表在Genomics & Informatics雜志上。

轉座元件（TEs）約占牛基因組的一半。它們可以是一個強大的物種特異性標記，在基因組進化時沒有結構變異（SV）的回歸突變。因此，作者應用naica️^®微滴芯片數字PCR系統對韓牛特異性SV進行準確的定量檢測。雖然樣品在韓牛群體中的等位基因頻率變化較低，但naica️^®微滴芯片數字PCR系統可以通過絕對定量進行高靈敏度檢測，可以做到比PCR更準確的定量。所以naica️^®微滴芯片數字PCR系統平臺相比于傳統PCR更適用于分子標志物的定量評價。

應用亮點：

▶  使用naica^®微滴芯片數字PCR系統對韓牛特異性SV進行準確的定量檢測。

▶ dPCR測定在計數單分子和分析特定群體的少量拷貝時可以高精度地定量，與qPCR相比，具有更高的準確性。

▶ 經過sanger測序，確定了naica️^®微滴芯片數字PCR系統檢測準確無誤，且操作和成本均低于測序。

▶ naica️^®微滴芯片數字PCR系統適用于分子標志物的定量評價。

實驗方法：

檢測樣本信息：

共提取了五個棕色韓牛DNA和五個荷斯坦DNA作為實驗樣本。

檢測方法：

為了更準確地檢測韓牛特異性SV，將“Del_96”位點應用于naica️^®微滴芯片數字PCR系統（Stilla Technologies）。進行naica️^®微滴芯片數字PCR系統前確認韓牛和荷斯坦牛的DNA的濃度定量。FAM引物組和FAM探針用于檢測韓牛和荷斯坦牛基因組。VIC引物組和VIC探針設計在韓牛特異性缺失（圖 1B)。因此，FAM引物組和FAM探針（陽性對照）設計在所有牛DNA中檢測。VIC引物組和VIC探針設計用于僅檢測韓牛的熒光。

▲圖 1B

實驗結果：

FAM染料在所有牛基因組中均被檢測到，VIC染料僅在韓牛樣品中顯示出顯著的檢測。這表明所有韓牛基因組都包含特定的缺失序列（Del_96區域）。在韓牛樣品中檢測到VIC染料的信號平均濃度為243（copies/ μL）。雖然在荷斯坦樣品中也檢測到平均濃度0.12（copies/μL）的VIC染料信號，但這些信號相比韓牛可忽略不計。

▲naica^®微滴芯片數字PCR系統檢測韓Del_96和荷斯坦樣品之間區域的絕對拷貝數比較。濃度圖在 X 軸上指示樣品數，在 Y 軸上指示對數刻度條（拷貝/μL）。（A）在所有樣品中檢測到FAM熒光。韓牛樣品的絕對拷貝數大約是荷斯坦樣品的兩倍。（B）僅在韓牛樣品中強烈檢測到VIC熒光。

最后，文章Results and Discussion給出-數字PCR適合作為驗證物種特異性標記的平臺。

綜上，對于naica️^®微滴芯片數字PCR技術，準確定量絕對拷貝數是一個關鍵特征，相比qPCR準確性更高，naica^®微滴芯片數字PCR為本文的檢測提供了有利的支持，也驗證了這一特征。在不久的將來，通過將物種識別工具應用于naica️^®微滴芯片數字PCR系統，它作為大樣本量物種鑒定平臺具有巨大潛力。所以naica️^®微滴芯片數字PCR系統適合作為驗證物種特異性標記的平臺。

原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7120350/

期刊介紹：

Genomics & Informatics是由韓國基因組組織發行的涉及農業和生物科學、生物化學、遺傳學、分子生物學、健康信息學等領域的期刊。