INTRODUCTION

某個患者的癌癥會持續發展直至轉移嗎？這是基礎保健、腫瘤學、預防醫學、流行病學以及醫療保健系統持續關注的問題。這一問題需要具有高度靈敏和特異性的同時且低成本的“液體活檢”技術來解決。腫瘤在其生長過程中釋放到循環系統中的多種成分就成為了解決這一問題的突破口，其主要包括循環腫瘤細胞及其團簇、ctDNA、EVs、蛋白質等。

癌癥早期診斷的關鍵問題是：哪種血液成分最適合檢測；某一個標志物的含量（罕見或超罕見）；對于特定的癌癥，包括癌癥發生的位置，這個標志物有多獨特？

1.為什么是EV而不是CTC或者ctDNA

EVs的優勢首先在于其含量豐富，腫瘤細胞在生長過程中可持續不斷地分泌EVs并進入循環系統，且因其代謝速率高導致EV的產量也遠高于正常細胞。此外，相比于ctDNA的生成依賴于腫瘤細胞的死亡，EVs由活細胞所產生，它的產生更像是一個持續發生的事件，可以實時反映腫瘤發展的進程。例如，在晚期黑色素瘤中，含有突變等位基因BRAFV600E和cKITD816V的DNA更多與EVs之間并無相關性，但并不能據此判斷為早期黑色素瘤；而另一項研究發現了exoDNA和ctDNA之間具有很好的相關性，但exoDNA的KRAS突變的存在與新輔助治療后的疾病進展緊密相關。此外，EVs的磷脂雙層膜結構可有效保護其所運載的RNA和蛋白質，避免其在循環系統中的降解，使得RNA和蛋白可被用于腫瘤的“液體活檢”。

圖1. 液體活檢在癌癥分析中的作用

2.為什么要進行單EV分析？

現有的文獻模型通常認為外泌體以及其它EVs包含有大量的蛋白質和核酸。這些觀點大多數基于不考慮異質性的前提下，對一群EVs選用的集權平均的分析方法獲得的結果。隨著EV研究的深入，科學家發現單個EVs上的蛋白質和核酸遠沒有那么豐富，只有很小一部分EVs含有腫瘤特異的標志物，如突變的蛋白質等（圖2）。那如何在循環系統這一EVs的汪洋中檢測出這部分高度特異但是稀有的ctEVs？此外，高度的異質性是EVs的主要特征之一，即使來源于同一個細胞的EVs之間也是千差萬別，且腫瘤群體中的細胞本就具有極大的多樣性。基于以上因素，EVs的單顆粒水平分析就成為了基于EVs的“液體活檢”的必經之路。

圖2. EV的組成

單個EV分析技術的優勢之一就是能夠揭示EVs的異質性，并將EV蛋白、核酸組成與親代細胞的組成進行比較。在單個EVs水平，蛋白標志物的含量比mRNA以及DNA生物標志物的含量高很多，且這些腫瘤相關標志蛋白可被抗體簡單有效識別。最近，來自麻省總院的Weissleder教授團隊發現即使幾乎所有的ASPC1細胞（人轉移胰腺癌細胞系）均表現為KRASmut，P53mut或者其他生物標志物（MUC1，EGFR或FG-P4OH等）陽性，但其所產生的EVs也僅有40%表現出KRASG12D陽性或P53mut陽性。類似的現象在其它胰腺癌細胞系中也均有發現，即從細胞上清中收獲的EVs中大約40-50%沒有相關腫瘤標志物的表達。

人血液中的ctEV被其他細胞衍生的EVs進一步稀釋了，那血液中ctEV的豐度和異質性如何呢？有模型計算得出，人體內的腫瘤每增大1 mm3，每毫升血液中相應地會增加23-1900個ctEVs。即使是分泌速度最慢的腫瘤細胞，其所釋放EVs的速度也比非腫瘤細胞高至少一個數量級。這個結果與很多文獻報道的發現吻合，在晚期腫瘤患者體內，均發現循環囊泡的數量成倍增加。因此，一種靈敏的檢測方法，如果能在1 mL血液中檢測出小于1 mm3的腫瘤，將有望把癌癥早期檢測和監控提前幾年甚至十幾年。可惜目前絕大多數的分析技術遠遠達不到這么高的靈敏度。由于非特異性的背景信號占據主導和并非所有的ctEVs的癌癥特異標志物都是陽性的這兩大原因，傳統的集權平均的方法，如WB和ELISA等，能夠測到小于1 cm3的腫瘤的概率微乎其微。而新型單囊泡分析技術在這一領域則被寄予厚望。

3.單個EV分析技術

針對EVs的集權平均分析方法的相關綜述屢見不鮮，而利用EVs真正實現癌癥早期診斷的報導則屈指可數。近5年才開始陸續出現能夠實現單個EV的表型分析的方法，其中大多數方法利用熒光傳感，光散射或者電子吸收等原理。典型的研究型方法包括透射電鏡，冷凍電鏡，原子力顯微鏡，超分辨熒光顯微鏡，全內反射熒光顯微鏡，拉曼光譜等，而這些方法往往伴隨著需要比較多的操作時間、貴重的儀器設備以及專業的操作技能，通量低等局限性。

經過多年的持續發展，在臨床環境中實現單EV分析并且具有診斷前景的技術已經出現，主要圍繞分離或者傳感等需求。這些方法在準確度、復雜程度、診斷時長以及每個樣品的花費方面均有差異。其中，無偏見單EV分析已經成功應用于幾種癌癥類型的診斷，包括結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、黑色素瘤以及胰腺導管腺癌（PDAC）等。

需要特別指出的是，納米流式檢測技術（NanoFCM）是一個備受關注并被寄予厚望的技術領域，有可能實現快速高通量、自動化和規模化。

早在2018年，就有學者利用納米流式檢測技術在單EV水平實現了結直腸癌的早期診斷。今年廈門大學的科研團隊基于EVs發展了鼻咽癌的早期診斷方法，AUC可達1.000，該方法同時可實現鼻咽癌和鼻咽炎的區分。(廈大團隊揭秘如何通過EVs區分癌癥和炎癥)

4.如何分離純化EVs?

從復雜的體液環境中獲得高純度的EVs，一直是EV研究和臨床應用中亟需突破的重要瓶頸。目前市面上的EV分離方法，所需的時間和獲得EV的純度都有差異。務實地說，方法的選擇取決于要解決的是臨床前還是臨床的問題。超速離心（密度梯度離心）是EV分離最經典的方法，但耗時長和回收率低是一直被詬病的問題。一些更快速的方法，如聚合物沉淀、免疫捕獲以及超濾、尺寸排阻色譜等也可以提供EV分離的方案，它們各自有獨特的優勢和局限性。

不管選用什么分離純化方法，都需要進行嚴格的質量控制確保EV的富集效率和純度，檢測一些指標：合理的尺寸和電性；可控的凋亡小體、脂蛋白或者其他蛋白團聚體的干擾。

在早期的推文中，小編詳細介紹過血漿來源EVs的常見分離純化方法對比（做外泌體，我的純化方法靠譜嗎？如何質控？）以及不同來源的EVs的分離純化方法的比較分析（外泌體分離純化方法——適合自己的才是最好的！），感興趣的小伙伴們可以回顧一下。

5.EV進入臨床診斷的難點？
目前基于EV的發現研究絕大多數基于集權平均的分析方法，且鮮有驗證研究的報道。一種方法能否進入臨床，有一些先決條件：
（1）處理小體積血漿的能力
（2）速度快且高通量
（3）自動化和規模化
（4）重現性
（5）合理的花費

單EV分析中的大多數技術挑戰已經被攻克，但仍然存在一些重要挑戰。這其中包括需要更深層次的分析手段來：
（i）鑒別良性和惡性EVs
（ii）確定循環腫瘤衍生的EVs（ctEVs）的器官來源
（iii）更好的理解不同癌癥中EVs的異質性
（iv）發現新的有潛力的EV生物標志物
缺乏嚴格、控制良好的臨床研究是其中一個尤為重大的挑戰。
早期診斷對于腫瘤的干預和治療的重要性是毋庸置疑的。單個EV的分析將探索和闡明循環EVs帶入到一個令人興奮的新研究領域，希望其作為新興的臨床分析方法可以用于各種不同惡性腫瘤的早期篩查。

參考文獻

·Scott Ferguson et al. Single extracellular vesicle analysis for early cancer detection [J]. Trends in Molecular Medicine, 2022; 28, 681-692.

·Scott Ferguson et al. Single-EV analysis (sEVA) of mutated proteins allows detection of stage 1 pancreatic cancer [J].Science Advances, 2022; 8eabm3453.

·Ye Tian et al. Protein Profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry [J]. ACS Nano, 2018; 12: 671-680.

·Huilin Shao et al. New technologies for analysis of extracellular vesicles [J]. Chemical Review, 2018; 118: 1917-1950.

·Liang Dong et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium [J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2020; 10:e12044.

·Ye Tian et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry [J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2020; 9:1697028.

·Yunyun Hu et al. Noninvasive Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma Based on Phenotypic Profiling of Viral and Tumor Markers on Plasma Extracellular Vesicles [J]. Analytical Chemistry, 2022, 94, 24, 9740-9749.