導(dǎo)讀

在PCR實(shí)驗(yàn)中，我們加完反應(yīng)體系后，都會(huì)認(rèn)真仔細(xì)的蓋好蓋子，并反復(fù)確認(rèn)已經(jīng)蓋好了蓋子，以避免出現(xiàn)試劑蒸發(fā)的情況。可是有時(shí)候我們也會(huì)有一些疑惑：明明已經(jīng)確認(rèn)蓋子蓋緊了，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，還是會(huì)出現(xiàn)試劑蒸發(fā)的現(xiàn)象。這是為什么呢？

其實(shí)試劑的蒸發(fā)是PCR實(shí)驗(yàn)中常見的問題之一，影響試劑蒸發(fā)的因素也比較多。

蒸發(fā)是指試劑在PCR實(shí)驗(yàn)過程中，反應(yīng)液在高溫下氣化，又凝結(jié)在管壁或頂蓋上，形成水霧或水珠，或直接從管蓋或覆膜的氣隙中溢出，造成反應(yīng)液濃度變化、反應(yīng)液量減少，有的甚至蒸干，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無效等。

影響試劑蒸發(fā)的因素主要有以下三點(diǎn)：

01熱蓋壓力、溫度

在PCR實(shí)驗(yàn)中，我們一般通過加熱蓋的辦法來防止試劑蒸汽的凝結(jié)，熱蓋溫度一般比反應(yīng)液的溫度高，以防止蒸汽凝結(jié)。

PCR 儀的熱蓋大致可以分為以下四種：非可調(diào)式熱蓋、可調(diào)節(jié)式熱蓋、自適應(yīng)式熱蓋和自動(dòng)式熱蓋。而可調(diào)節(jié)式熱蓋利用手?jǐn)Q壓緊式，擰不緊會(huì)發(fā)生試劑蒸發(fā)，通過增加熱蓋壓力可以盡量減少邊緣蒸發(fā)的現(xiàn)象。有時(shí)擰得過緊反而可能出現(xiàn)壓壞管子、擰壞旋鈕的情況。通常，采用電動(dòng)智能熱蓋，能夠自動(dòng)感應(yīng)不同高度的耗材，自動(dòng)壓緊耗材，壓力均勻且恒定，從而能夠減少試劑蒸發(fā)和人工誤差，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。

02耗材形變

對(duì)于蒸汽的泄漏，大部分人認(rèn)為是熱蓋的壓力不夠所致。熱蓋的壓力固然很重要，但這僅僅是一個(gè)方面，其實(shí)耗材也很關(guān)鍵。

PCR 孔板通常為塑料材質(zhì)，在受熱后發(fā)生膨脹，產(chǎn)生較大地變形，用于放置 PCR 孔板的 PCR 金屬基座則受熱膨脹率極小，PCR 孔板受熱膨脹后不能正常沿平面延展進(jìn)而中間形成拱起狀態(tài)，從而造成上方熱蓋不能全面地與 PCR 孔板上表面充分接觸，造成溫度、壓力不均，引起 PCR 孔板邊緣試劑的蒸發(fā)，影響 PCR 檢測效果。

03耗材密封不嚴(yán)

熱蓋與耗材壓緊并不等于蓋緊了 PCR 管蓋，PCR 孔板質(zhì)量參差不齊。優(yōu)質(zhì)的耗材，管口和蓋子表面光滑，盒蓋后密封性好，不易泄漏。而劣質(zhì)耗材，管口不平，有徑向紋路，容易造成泄漏，甚至蒸干。

因此在PCR實(shí)驗(yàn)中，盡量選擇優(yōu)質(zhì)、合適的耗材。同時(shí)也可以擴(kuò)大反應(yīng)體系，盡量減少體系蒸發(fā)對(duì)反應(yīng)的影響。