終末期腎病（ESRD）是慢性腎臟病（CKD）的一種晚期并發癥，是全世界引起高死率亡的主要原因之一。目前，治療ESRD的費用驚人，僅在美國每年大約需要花費340億美元。

代謝組學文獻分享，阿趣生物協助客戶中國農業大學任發政院士和于政權教授與團隊在國際權威期刊《Gut》(IF:17.943)上發表過關于ESRD的最新研究成果，整合腸道菌群、血清和糞便代謝組多組學數據，建立223名血液透析患者和69名健康對照者的大規模隊列，以及24名個體的獨立驗證隊列，表明產毒的腸道菌群通過產生有害代謝物加重ESRD臨床預后，揭示在未來的臨床對照實驗（CCT）中可通過調節腸道菌群的方法降低患者的尿毒癥毒性，提高生存質量或減少對透析治療和腎移植資源的需求。
 

題目：Aberrant gut microbiota alters host metabolome and impacts renal failure in humans and rodents
樣本類型：臨床血清、糞便
期刊：Gut
影響因子：17.943
發表時間：2020年4月2日
 

技術路線

采集235例ESRD患者和81例健康對照者臨床指標信息，并進行血清代謝組、糞便代謝組、糞便宏基因組的實驗。代謝組學文獻分享，技術路線如下圖所示：

（A）組學類型；

（B）基于ESRD患者組和健康組數據的差異物篩選；

（C）多組學數據相關性分析；

（D）與代謝物相關的宏基因組預測模型建立和聚類的CAG（Co-abundance genes）分析；

（E）動物實驗驗證ESRD患者腸道菌群和益生菌治療作用。
 

研究結果

1.ESRD患者與健康人的血清代謝譜不同
采用非靶代謝組技術檢測血清樣品，鑒定到180個血清代謝物，篩選到134個差異物（圖1A）。代謝組學文獻分享，ESRD組和對照組血清代謝譜明顯不同；鑒于患者群體相對于原發性疾病類型的異質性，作者將其分為三種主要類型：腎小球腎炎（n=76）、糖尿病腎病（n=73）和其他（n=74），并分別與對照組進行比較。發現血清代謝物中占比≥97%的物質在整個人群中顯示為不同，只有少量代謝物（<9%）在不同組中具有顯著不同的豐度。這表明ESRD血清代謝組在很大程度上與原發病無關。

ESRD血清代謝組的主要特征是9種尿毒癥毒素的富集和膽汁酸組成的不平衡（如結合膽汁酸與非結合膽汁酸、初級膽汁酸與次級膽汁酸（SBAs））（圖1C）。通過對隨機選擇的60名患者（ESRD患者，n=40；健康對照組，n=20）目標代謝物檢測，證實了ESRD患者中尿毒癥毒素的累積。據報道，這類毒素是由腸道菌群通過降解芳香族氨基酸（AAAs）和多酚產生的，氧化三甲胺（TMAO）例外，它是由細菌降解膽堿和肉堿產生的。
 

圖1 與ESRD患者明顯相關的血清和糞便代謝譜特征

2.ESRD患者的糞便代謝組的變化與血清代謝組相關

ESRD組和對照組的糞便代謝組實驗共鑒定255個物質，其中有98個差異代謝物（圖1D）。尿毒癥毒素前體和SBA在ESRD組表達量上調，初級膽汁酸，短酸（SCFAs）及其衍生物表達量下調。代謝組學文獻分享，這些代謝物占糞便代謝組差異物的49.6%。Procrustes分析表明血清和糞便代謝譜具有很強的協同性（圖1F）。

最重要的是，血清尿毒癥毒素與其糞便前體密切相關，這表明ESRD患者腸道代謝物的變化對血清中尿毒癥毒素的積累有顯著貢獻。為了進一步驗證代謝組學結果，作者增加了一個獨立隊列，包括12名ESRD患者和12名健康對照。ESRD患者血清尿毒癥毒素的積累在新隊列中得到證實（補充圖7A）；同樣，在患者糞便中，觀察到毒素前體升高，并伴有明顯的SCFAs和SCFA衍生物減少的趨勢（補充圖7B）。 
 

補充圖7 獨立隊列中血清和糞便代謝物的驗證

3.ESRD患者腸道菌群的分類和功能特征
為了研究腸道菌群是否介導了ESRD患者的代謝組變化，作者通應用宏基因組（Illumina HiSeq平臺）測序技術進行腸道菌群的研究，每個糞便樣本平均產生7470萬次讀取（11.2 Gb數據）。代謝組學文獻分享，鑒定900個宏基因組物種（MGS），其中約66%可以被鑒定到屬水平。利用基因圖譜，作者首先發現ESRD腸道菌群的微生物多樣性、分類組成和功能與健康人有顯著差異。

由于隊列中超過一半的物種發生了顯著變化（457/900 MGSs，51%），因而得出結論：ESRD可強烈影響腸道菌群。患者體內豐度上調的物種有Eggerthella lenta、Flavonifractor spp、Alistipes spp、Ruminococcus spp 和 Fusobacte rium spp（圖2B）。豐度下調的物種包括Prevotella spp , Clostridium spp 和幾種產丁酸鹽菌 (Roseburia spp, Faecalibacterium prausnitzii 和 Eubacterium rectale）。ESRD患者糞便中SCFAs的減少可能是由于產SCFA菌群的減少。與芳香族氨基酸（AAA）降解和SBA生物合成功能相關的菌群和基因在ESRD患者中高表達，與糞便代謝組的尿毒癥毒素前體和SBA結果一致。此外，這些功能與血清和糞便中相應ESRD相關代謝物的濃度顯著相關（圖2C）。可以得出的結論是，ESRD患者尿毒癥毒素的累積與腸道微生物群介導的AAA降解和微生物SBA生物合成有關。
 

圖2 ESRD患者血清和糞便中菌群特征及其與代謝物的變化關系

4.ESRD患者腸道菌群的改變介導代謝組的變化
為了進一步探討腸道菌群與代謝物之間的關系，作者對宏基因組、血清和糞便代謝組進行多組學關聯分析。在ESRD患者和健康對照組中都發現了緊密的聯系（圖3A，B）。代謝組學文獻分享，ESRD患者與健康對照組相關性網絡明顯不同，只有約12%的相關性是常見的。值得注意的是，尿毒癥毒素和膽汁酸占ESRD患者血清代謝物相關性的95.0%，明顯高于健康對照組（69.3%）。同樣，ESRD患者的血清尿毒癥毒素和膽汁酸也受到腸道菌群和糞便代謝組的顯著影響（圖3C）。

腸道菌群對ESRD患者代謝譜的影響相當大，分別占血清和糞便代謝組變異的31.3%和39.0%（圖3D）。這些結果表明，腸道菌群除了影響腎功能外，似乎是對宿主的糞便和血清代謝組的也具有一定的影響作用。
 

圖3 腸道菌群對ESRD患者血清和糞便代謝組的影響

5.ESRD患者的腸道菌群對毒素積累作用
為了進一步證實腸道菌群在尿毒癥毒素和SBA產生中的作用，作者重點關注預測編碼這些化合物的合成途徑中關鍵酶基因。鑒定了5134個編碼6種尿毒癥毒素和SBA關鍵合成酶的基因。代謝組學文獻分享，這些基因在ESRD患者中明顯更豐富。在此發現的指導下，作者應用隨機森林模型來確定每個毒素或SBA與包含毒素/SBA合成酶編碼基因的物種豐富度之間的相關性。

血清或糞便中毒素強度和SBAs濃度預測最大化的隨機森林模型確定了大約83種菌群（圖4）。與ESRD患者中尿毒癥毒素和收縮壓的增加一致，大多數（59%）菌群在患者中比在對照組中更豐富（圖4）。重要的是，與尿毒癥毒素或SBA產生相關的菌群與ESRD臨床指標直接且顯著相關。因此，作者假設至少部分腸道菌群通過尿毒癥毒素和SBAs加重ESRD。基于上述發現，產尿毒癥毒素和SBA的腸道菌群可作為ESRD的診斷標志物。
 

圖4 ESRD患者的腸道菌群有助于尿毒癥毒素
的產生及膽汁酸的生物合成

6.CDK（慢性腎臟病）小鼠動物模型的腸道菌群影響毒素積累和腎病發展
為了驗證以上假設，即腸道菌群至少部分通過尿毒癥導致腎衰竭，作者將來自ESRD患者或健康供體的新鮮腸道菌群移植到腺嘌呤誘導的CKD模型無菌小鼠體內。代謝組學文獻分享，發現接受ESRD腸道菌群移植的小鼠表現出更嚴重的腎纖維化、腎小球硬化和氧化應激，以及血清尿素和肌酐水平的升高趨勢。尿毒癥毒素（包括對甲酚硫酸鹽、苯乙酰甘氨酸、硫酸苯酯和硫酸吲哚酚）的血清水平顯著升高（圖5D）。這些結果表明ESRD患者腸道菌群的尿毒癥毒素的調節對腎臟疾病的發展起到了一定的作用。

緊接著，作者驗證了一個假設，即在腸道菌群中存在產尿毒素癥毒素前體的菌群，會加重腎病的發展。為此，作者移植ESRD患者菌群中高豐度的 E. lenta（預測參與馬尿酸和苯乙酰谷氨酰胺生成）和 Fusobacterium nucleatum（預測參與吲哚和苯酚的生成），發現可使CDK模型小鼠或大鼠的血清尿毒癥毒素升高，并加劇腎纖維化和氧化應激，這些結果表明菌群產生的尿毒癥毒素可加重腎臟疾病。那么可得到一個推論，減少相應菌群豐度會減輕疾病的嚴重程度。故而，作者給CKD大鼠灌胃動物雙歧桿菌A6（一種促進健康的益生菌），發現這兩種產毒素菌群E. lenta和 Fusobacterium nucleatum的豐度顯著降低。同時，血清尿毒癥毒素、肌酐和尿素濃度也顯著降低，腎纖維化和腎小球硬化程度降低。因而可通過動物雙歧桿菌調節產毒腸道菌群的作用治療CKD大鼠，減輕腎臟疾病的發展。
 

圖5 動物實驗證實ESRD患者腸道菌群促腎病發展
 

研究結論

在這項研究中，作者證明腎衰竭患者的腸道菌群具有加速一些有毒化合物生物合成的功能，導致尿毒癥毒素的濃度升高和加重腎臟疾病。ESRD患者產毒菌群對血清中尿毒癥毒素的積累有著重要的貢獻。這項工作有助于在人類受試者中建立腸道菌群與腎臟疾病發展之間的因果關系。代謝組學文獻分享，ESRD患者腸屏障容易受損，促進尿毒癥毒素前體進入循環系統。這將有助于血清毒素的積累。近期的研究結果表明，ESRD患者的腸道菌群可通過產生過量的苯酚來破壞腸屏障。

在腸屏障受損或破壞的情況下，更多的尿毒癥毒素可滲透到ESRD患者的循環中，加重腎臟疾病及其并發癥的發展。ESRD患者體內毒素積累的一個原因是傳統透析法不能有效地去除微生物衍生的尿毒癥毒素。因此，在未來臨床對照試驗中，對不同程度腎功能受損的患者，需要探索通過飲食、益生菌或其他治療手段調節腸道菌群能否減少解尿毒癥毒素的積累，提高患者的生存和生活質量，減少對透析治療或腎移植資源的需求。
 

文章延伸

阿趣生物為本研究提供了VOCs非靶標代謝組學檢測分析以及靶標代謝組學檢測分析服務。

代謝組學文獻分享，揮發性有機化合物（VOCs, Volatile organic compounds）通常是指常壓下，沸點在50℃-260℃的各種有機化合物。VOCs按其化學結構，可以進一步分為烷類、芳烴類、酯類、醛類和其他等。常見的有苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、苯乙醇、三氯甲烷、丁酸丙酯、2-壬酮、2-辛酮等。研究表明，VOCs與人體神經系統發育、肝臟毒性、血液系統等方面有重大關系。