自噬是一種細胞內的重要途徑，用于識別，去除和降解自噬小體內的胞內成分，細胞器以及病原體。自從被評為國自然重點以來，自噬的熱度一直居高不下。小優回顧了一下之前發的幾篇自噬相關的文章，都有較高的閱讀量。

LC3：隱秘的自噬標記物！
Nature:自噬促進胰腺癌免疫逃逸的機制
自噬與神經退行性疾病的關系一文帶你吃透，不點進來看看？

非編碼RNA也是今年的國自然熱點，是指一類不參與編碼蛋白質的RNA，但具有調節基因表達和蛋白質功能的特性，主要包括microRNA，siRNA，lncRNA，vtRNA等等。在最近幾年，非編碼RNA文章數也增長迅速。

近十年PubMed非編碼RNA相關文獻數

今天小優就從Cell期刊中為大家撈出了一篇關于自噬和非編碼RNA的精品高分文章。這篇文章來自德國海德堡的Matthias W. Hentze教授在Cell發表研究：The Small Non-coding Vault RNA1-1 Acts as a Riboregulator of Autophagy，希望能給大家提供更多的思路。

文章概述：
本文表明了vault RNA直接結合自噬受體sequestosome-1/p62。過表達vtRNA1-1抑制p62依賴的自噬。細胞饑餓會降低vtRNA1-1和P62的結合，從而誘導自噬。P62不能結合vtRNA的突變會增加P62的寡聚化，并增加和自噬效應物的關系。因此，vtRNA1-1可以通過集合P62和干擾寡聚化，從而直接調節自噬。

文章亮點：

文章首次發現并研究了P62和RNA的相互作用。該研究首次將自噬相關蛋白P62定性為RNA結合蛋白，并發現vtRNA可通過抑制P62的寡聚化，從而影響細胞自噬。

接下來小優就帶大家具體來解析下這篇文章，看看作者的研究思路和實驗方法。

1、自噬受體p62/SQSTM1是RNA結合蛋白
故事開始于作者使用了RBDmap技術鑒定RNA結合蛋白中與RNA相互作用的肽段。在結果中發現有一個肽段來自于自噬受體p62/sequestosome-1，表明P62與RNA相互作用。考慮到哺乳動物的自噬受體和RNA的相互作用還沒有人研究過，作者決定繼續研究。

作者使用WB和Co-IP技術進一步鑒定p62和RNA之間的關系。WB和Co-IP結果均顯示p62是一個RNA結合蛋白（Fig.1A and 1B）。然后作者用iCLIP技術確定是哪種RNA和p62結合。結果表明，有四種vault RNA和p62結合緊密。更多分析表明，p62優先結合在vtRNA的中心結構域的環狀區域（Fig. 1C,1D and 1E）。

綜上，結果顯示，p62和vtRNA的中心結構域有相互作用。

Fig.1 自噬受體p62是RNA結合蛋白

部分相關產品

2、Vault RNA 1-1是P62主要結合的RNA
作者進一步驗證vtRNA和p62的相互作用。作者使用了p62 RIP-qPCR技術進行驗證。作者發現vtRNA1-1是p62主要結合的RNA（Fig. 2A）。作者在多個細胞系進行驗證（Fig. 2B and 2C）。

接著作者用純化的蛋白和放射性標記的RNA進行EMSA實驗。作者在構建p62的質粒的時候在N端加上了MBP標簽，然后用MBP的填料進行純化。結果表明MBP-62和vtRNA1-1形成復合物。

為了驗證MBP-p62和vtRNA1-1的相互作用是否是特異性的，作者使用非標記的tRNA作為特異性的競爭者，IRE或者細菌tRNA作為非特異性的競爭進行實驗。結果表明，非標記的tRNA可以有效的和標記的vtRNA競爭，而IRE或者細菌tRNA不能競爭（Fig.2D）。

綜上，p62在體外可以特異性的結合vtRNA1-1。

Fig.2 P62結合Vault RNA1-1

部分相關產品

3、vtRNA1-1抑制p62介導的自噬
接下來作者想要繼續研究vtRNA1-1和p62相互作用的意義。首先作者驗證p62會不會介導vtRNA的溶酶體降解。結果表明，無論是在p62干擾或者敲除的細胞中，vtRNA的表達水平都沒有影響（Fig 2F and 2G）。

接下來作者進行反向研究，看看vtRNA1-1會不會影響p62在自噬中的功能。作者在細胞中敲低 vtRNA1-1，監測自噬流通過檢測兩個參數，LC3B-1到LC3B-II在自噬體組裝中的轉換，以及p62的水平反映自噬溶酶體降解。結果表明，vtRNA1-1敲低會刺激LC3B的轉換（Fig. 3A and 3B），表明自噬流的增加。為了驗證這個現象是否依賴于p62，作者同時去除了p62和vtRNA1-1。作者發現，去除P62會部分減緩LC3B的轉換速率在vtRNA1-1敲除之后（Fig. 3C）。免疫熒光實驗也顯示，vtRNA1-1的去除表現為LC3B數量增加（Fig. 3D and 3E）。

作者也檢測了vtRNA1-1表達增加會發生什么。檢測發現，vtRNA1-1表達增加會抑制LC3B的轉換，并且會引起p62的積累（Fig. 3G），表明自噬流的下降。相對的，其他vtRNA的過表達不會影響LC3B的轉換速率。

綜上，vtRNA1-1表達上調和下調都會影響p62依賴的自噬。

Fig.3 vtRNA調節P62依賴的自噬

部分相關產品

4、p62結合vtRNA1-1主要通過鋅指結構域

為了研究vtRNA1-1抑制p62功能的機制，作者決定構建一些p62的突變體。P62有多個結構域，每個結構域都有對應的功能，但是沒有傳統的RNA結合的區域（Fig. 5A）。為了鑒定p62的RNA結合區域，作者使用RBDmap數據并且檢查了在ZZ結構域中RBDpep附近的區域（Fig. 5A and 5B）。作者從HuH-7細胞中敲低內源的p62，然后將一些p62變體轉染到細胞中。結果表明，p62 K141A變體展現了很強的降低RNA結合的作用(Fig. 5C)。

接著，作者用P62 KO細胞進行驗證。作者使用CRISPR/Cas9技術構建了HuH-7 P62 KO的細胞株。然后轉染一個三突變體，R21A，D69A和D73A。p62 PB1m也同樣會降低RNA的結合（Fig. 5D）。

綜上，p62主要通過鋅指結構域結合vtRNA1-1。

Fig. 5 P62結合vtRNA1-1主要通過鋅指結構域

5、vtRNA調節p62和Atg8蛋白家族的相互作用

作者進一步對下游機制進行研究。首先作者驗證是否RNA的結合會影響p62和Atg8蛋白家族的LC3B和GABARAP的相互作用。通過Co-IP實驗，作者發現敲低vtRNA1-1，P62和LC3B的相互作用降低（Fig. 6A）。同樣的現象也表現在vtRNA1-1 KO的HuH-7細胞中(Fig. 6B)。

作者進一步使用p62 KO的HuH-7細胞轉染p62 WT，PK/A和PB1m質粒。結果表明，p62 RK/A表現出和GABARAB更強的相互作用（Fig. 6C and 6D）。而p62 PB1m展現出對LC3，GABARAP和NBR1較低的結合（Fig. 6C and 6D）。

綜上，去除vault RNA1-1或者使P62 RNA結合缺失都會增加P62和LC3B和GABARAP的結合，這些數據表明vault RNA1-1的結合影響P62和Atg8蛋白家族的相互作用。

Fig. 6 vtRNA1-1影響P62和Atg8蛋白家族的相互作用

部分相關產品

總結
在這篇文章里，作者使用了多種方法研究vtRNA和P62的相互作用以及對自噬的影響，例如Co-IP，iCLP，RIP-qPCR，EMSA，CRISPR/Cas9，蛋白純化等等。具體的實驗方法在文獻中都有詳細介紹。今天想為大家重點介紹一下蛋白純化的方法。

為了更加方便的改造蛋白或者更加便宜和便捷的大量得到某種目標蛋白，現在越來越多的實驗室都在選擇蛋白純化的方法進行蛋白的純化和改造。蛋白純化的步驟主要分為：質粒構建——蛋白表達——蛋白純化，可以選擇使用原核或者真核生物作為表達體系。具體的操作方法和視頻，大家可以點擊查看原核標簽蛋白純化解決方案，里面有詳細的操作步驟和視頻提供給大家，千萬不要錯過哦！

像文章中純化P62時加上的MBP和His標簽也是蛋白純化常用的標簽。首先作者構建了MBP-p62-his質粒，然后在 E.coli BL21(DE3)大腸桿菌表達體系中進行表達。在37℃培養了6小時之后，細胞恢復到室溫，然后在20℃繼續培養16H。細胞加入裂解液 (50mM HEPES pH 8.0, 1M NaCl, 0.5 mM TCEP, 1x protease inhibitor)，并且使用超聲進行裂解。然后用His標簽預裝柱和MBP標簽預裝柱進行純化。

常見的純化標簽及區別