隨著納米二氧化鈦材料 (nTiO₂)在各種工業產品中的廣泛生產和使用，人們日益關切其對環境造成的潛在的生態和健康風險。研究表明，nTiO₂在紫外照射下產生的活性氧對微生物產生不利的生物效應，但也有報道指出，在黑暗中長期接觸nTiO₂可誘導細菌細胞壁增厚和生物膜形成，促進微生物適應環境。因此，nTiO₂對微生物造成何種影響，需要深入而細致的探討。
 

2022年3月，來自湘潭大學的張鵬研究團隊在Journal of Hazardous Materials （IF 14.224）上發表題為”Quantitative proteomics and phosphoproteomics elucidate the molecular mechanism of nanostructured TiO₂-stimulated biofilm formation”的文章，該研究整合蛋白質組學與磷酸化修飾組學探討微生物適應納米材料的分子機制。本研究發現，nTiO₂顯著改變活性污泥中菌群結構，其中大腸桿菌可通過形成生物膜適應亞致死的nTiO₂。中科新生命為其提供了蛋白質組學和磷酸化修飾組學技術服務。

研究材料

nTiO₂，Escherichia coli K12

技術路線

步驟1：nTiO₂選擇性富集細菌病原體并增加微生物群落的多樣性；

步驟2：nTiO₂脅迫下大腸桿菌蛋白質組學及磷酸化修飾組學分析；

步驟3：nTiO₂通過增強鐵的吸收促進生物膜的生成；

步驟4：nTiO₂通過增強轉錄和翻譯過程提高大腸桿菌對抗菌劑適應性；

步驟5：nTiO₂通過CsgD的去磷酸化增加了生物膜的生成。

研究結果
 

1. nTiO₂選擇性富集細菌病原體并增加微生物群落的多樣性

研究人員向活性污泥中分別添加0、5、50 mg/L nTiO₂，30h后觀察脅迫條件下生物膜的生長情況。結果顯示，隨著時間的推移，生物膜生物量逐漸增加，并且暴露于nTiO₂的活性污泥具有更高的細菌豐度和群落多樣性。尤其是一些條件致病菌豐度顯著增加，如腸桿菌屬、乳球菌屬等。總之，nTiO₂暴露顯著改變了活性污泥中微生物群落結構，促進了生物膜的形成。

圖1 nTiO₂對活性污泥生物膜形成及菌群豐度的影響

2. nTiO₂脅迫下大腸桿菌蛋白質組學及磷酸化修飾組學分析

為了解析nTiO₂促進生物膜形成的機制，研究選取大腸桿菌分析了nTiO₂暴露引起的蛋白表達及磷酸化修飾層面的變化。蛋白質組學及磷酸化修飾組分別鑒定到2937個蛋白和350個磷酸化肽段和741個修飾位點。GO和KEGG分析顯示，上調表達的蛋白中顯著富集鐵轉運和維持鐵穩態相關通路，以及核糖體蛋白和RNA聚合酶亞基蛋白。這些結果表明，nTiO₂脅迫影響了細菌對鐵元素的利用，增強了RNA轉錄和蛋白翻譯過程，可能影響細菌對轉錄和蛋白質合成抑制類抗生素的耐藥性。

圖2 不同濃度nTiO₂作用于大腸桿菌9h后的多組學分析


圖3 nTiO₂暴露組與對照組的蛋白調控網絡

3.  nTiO₂通過增強鐵的吸收促進生物膜的形成

通過對暴露于50mg/L nTiO₂下的大腸桿菌生物膜進行蛋白質組學分析，發現對鐵元素有高親和力的大腸桿菌素合成蛋白以及鐵元素轉運蛋白表達上調明顯，研究者猜測nTiO₂促進細菌對鐵的利用來增強對環境的適應性。因此，研究人員利用三價鐵螯合物來驗證鐵元素對nTiO₂脅迫下生物膜生長的影響。實驗表明，外源鐵螯合劑干擾了細菌對鐵的吸收，破壞了生物膜的發育，這進一步證明了nTiO₂通過增強鐵的吸收促進生物膜的生成。
 

圖4 nTiO₂對微生物鐵獲取系統的影響

4. nTiO₂通過增強轉錄和翻譯過程提高大腸桿菌對抗菌劑適應性

為了深入探究大腸桿菌是否通過調控轉錄和翻譯過程來響應nTiO₂脅迫，研究人員在細菌培養基中添加不同類型的轉錄和蛋白質合成抑制劑，分析nTiO₂對大腸桿菌適應性的影響。結果顯示，蛋白合成抑制劑四環素處理下的nTiO₂暴露組生物膜含量與對照組相當，表明蛋白質合成過程并未參與調控大腸桿菌對nTiO₂脅迫下的適應性。而轉錄抑制劑利福平處理下nTiO₂暴露組生物膜含量顯著高于對照組，表明nTiO₂通過調控轉錄過程增加大腸桿菌的適應性。nTiO₂處理導致利福平的靶標蛋白RpoB磷酸化修飾顯著下調，這一調控是nTiO₂提高大腸桿菌對轉錄抑制劑耐藥性的主要機制。

圖5 大腸桿菌對蛋白質合成抑制劑及轉錄抑制劑的耐藥性研究

5. nTiO₂通過CsgD的去磷酸化增加了生物膜的生成

CsgD是已報道的調控大腸桿菌生物膜形成的關鍵轉錄調節子，調控胞外多糖、菌毛和纖維素的合成，而纖維素作為線性多糖聚合物，是生物膜形成的重要保護支架。本研究組學結果顯示，nTiO₂處理誘導CsgD磷酸化修飾水平顯著下調，而生物膜合成有關的BcsB、BcsZ、BcsC、SecG和SesY等在蛋白水平顯著上調。去磷酸化形式的CsgD可特異性結合到adrA啟動子區域并激活器其轉錄，而通常AdrA通過上調環二鳥苷酸水平介導BcsBAZC等蛋白合成纖維素。總之，nTiO₂誘導的CsgD蛋白磷酸化修飾變化，介導了大腸桿菌生物膜形成的調控過程，從而影響大腸桿菌對亞致死濃度的nTiO₂適應性。

圖6 nTiO₂對生物膜基質形成過程中細胞外組分的影響

 小編小結

盡管納米材料和微生物之間的相互作用具有廣泛的生態和健康影響，但微生物對納米材料的適應機制仍不清楚。本研究中，在黑暗條件下暴露于nTiO₂的活性污泥中形成的生物膜生物量增加，并選擇性地富集病原體。蛋白質多組學分析結果表明，nTiO₂脅迫進一步導致條件致病菌的鐵載體過表達，通過相關轉錄翻譯蛋白的去磷酸化增強其耐藥性。nTiO₂會促進生物膜的生成，提高致病菌的適應性，從而會加速生物污染，導致潛在的生態和健康風險。