腸道菌群與宿主緊密合作，對機體的生理調節產生影響，尤其在腦部發育和功能調節以及自閉癥、焦慮癥、抑郁癥等疾病中發揮著關鍵作用。臨床研究顯示大約3/4的自閉癥患者同時伴有某些胃腸功能異常，這一現象促使科學家們探究腸道微生物與自閉癥之間的潛在聯系。近期研究表明，自閉癥患者的腸道菌群與對照組存在顯著差異，但微生物如何影響自閉癥依舊是未解之謎。來自加州理工學院Sarkis Mazmanian團隊篩選出了一個可能介導腸道菌群和自閉癥的代謝物——4-乙基苯酚硫酸鹽（4-ethylphenyl sulphate, 4EPS）。酪氨酸可以被腸道微生物群代謝成4EP，隨后4EP在宿主磺基轉移酶（SULT1A1）作用下生成4EPS。4EPS進入小鼠大腦，影響特定大腦區域的激活和連接，并破壞大腦中少突膠質細胞的成熟和髓鞘形成模式，進而調控小鼠大腦活動和焦慮樣行為。相關成果發表于《Nature》。

1. 4EPS生物合成途徑研究

先前研究發現非典型神經發育小鼠模型中代謝產物4EPS相對豐度較高，并且4EPS可以改變幼年小鼠野外試驗中的行為。在自閉癥譜系障礙患者(ASD)血漿中4EPS也是增加，同時在CNTNAP2小鼠ASD模型中4EPS的變化一致。由于無菌小鼠 (germ-free, GF) 中檢測不到4EPS，由此推測，腸道微生物組的基因可以將酪氨酸轉化為4EP，然后被宿主硫酸化為4EPS（圖1a）。有研究顯示，厚壁菌門（Firmicutes phylum）中一些罕見細菌可以利用對香豆酸（p-coumaric acid）產生4EP，而p-coumaric acid前體包括酪氨酸和一些植物性分子。事實上，以富含酪氨酸的魚類為主的飲食和以大豆為主的飲食常規定殖小鼠中都可以檢測到4EPS。通過篩選候選腸道細菌，研究者發現卵形擬桿菌Bacteroides ovatus（B.ovatus）可以將酪氨酸轉化為p-coumaric acid。使用BLAST工具 (Basic Align ment Search Tool)，在B.ovatus中鑒定出一個關鍵酶—酪氨酸解氨酶(BACOVA_01194)，該酶的缺失將致使B.ovatus失去產生p-coumaric acid的能力（圖1b）。研究者將B.ovatus和Lactobacillus plantarum（可將p-coumaric acid轉化為4EP）共同定植于GF小鼠中，在小鼠尿液中僅能檢測到低水平的4EPS。為了提高4EPS水平，對菌株進行工程改造, 改造后的B.ovatus菌株B.ovatus1194/PAD（MFA05）能將酪氨酸轉化為中間產物4-乙烯基酚（4-vinylphenol），在與L.plantarum共培養的條件下，4-vinylphenol代謝為4EP。相反，B. ovatusΔ1194突變體（MFA01）與L. plantarum共培養時，不產生4EP（圖1c,1d）。

▲ 圖1. 4EPS生物合成途徑及菌種基因工程改造

2. 菌種定植小鼠4EPS研究

研究者在GF小鼠中分別定植B.ovatus1194/PAD和B.ovatusΔ1194菌株，進而獲得4EP+和4EP-小鼠。與預期結果一致，4EP+小鼠糞便中可以檢測到4EP（圖1e），并且在其血清和尿液中檢測到4EPS（圖1f）。用丙磺舒（probenecid，抑制小分子通過血腦屏障外流的有機陰離子轉運體）處理4EP+小鼠后，可以在其大腦中檢測到4EPS，表明4EPS可以在大腦中積累（圖1g）。4EP和4EPS是酚類分子，可能具有毒性或炎癥特性。但4EP+和4EP-小鼠在體重或自由活動方面沒有明顯差異，菌群定植水平相似，同時4EP+小鼠沒有表現出腸道功能障礙，結腸組織和血清中沒有促炎反應。4EP+小鼠大腦中細胞因子趨向于抗炎，且4EP+小鼠中沒有小膠質細胞激活的特征。表明研究者建立了一個簡化的動物模型，該模型再現了與行為改變相關的腸道微生物代謝物暴露的自然途徑。

3. 4EPS對大腦活動影響及機制研究

4EP(S)可能對各種器官都有影響，該研究中主要圍繞大腦組織開展。通過功能超聲成像評估4EP+和4EP-小鼠全腦功能連接差異：與4EP-小鼠相比，4EP+小鼠信號傳導模式發生改變，主要發生在海馬、丘腦、杏仁核、下丘腦、梨狀體和皮層，提示4EPS升高與小鼠大腦各區域間功能連接異常有關。隨后通過葡萄糖攝取實驗比較了大腦的神經活動：4EP(S)與下丘腦亞區（前部、外側和室旁核）、杏仁核（前部、基底外側、中央和皮層）和終紋床核，以及丘腦室旁核的葡萄糖攝取增加有關。這些數據表明，4EP(S)會導致多個大腦區域的功能連接和活動改變，包括幾個與邊緣系統相關的區域。

為了探究4EP(S)影響大腦活動的分子機制，作者對4EP+和4EP-小鼠的六個腦區（PVT、基底外側杏仁核、下丘腦、BNST、內側前額葉皮層和腹側海馬體）進行mRNA測序分析。結果顯示4EP(S)主要影響PVT基因表達，對BNST和基底外側杏仁核的影響較小。與4EP-小鼠相比，4EP+小鼠PVT中神經元、新形成的少突膠質細胞和成熟少突膠質細胞特異性基因的表達降低，表明這些細胞類型的發育、豐度和/或活性的降低與4EP(S)有關。進一步分析發現，4EP+小鼠中未成熟的少突膠質細胞前體細胞增加，成熟少突膠質細胞減少，泛神經元標志物NeuN和泛少突膠質細胞標志物OLIG2水平保持不變，表明4EP(S)影響少突膠質細胞的成熟，而不是該譜系內細胞總數的變化。同時研究者發現4EP+小鼠全腦和胼胝體中神經元髓鞘形成減少。

▲ 圖2. 定植產生4EP菌種對小鼠全腦功能連接和區域激活的影響

▲ 圖3. 4EP+小鼠腦中少突膠質細胞成熟度降低

4. 4EP(S)可誘導焦慮樣行為出現

研究者探究了腸道4EP(S)的產生是否可以調節小鼠行為，數據結果顯示4EP(S)在幾種常見行為學檢測中均可以促進顯著的焦慮樣行為：（1）高架十字迷宮中，4EP+小鼠在開放臂末端停留時間更少；（2）曠場探索中，4EP+小鼠進入暴露區域的時間更少；（3）黑白箱實驗中，4EP+小鼠在黑暗中停留時間更多。4EP+小鼠也表現掩埋行為增加，反映了焦慮和/或刻板行為特征。值得注意的是，富馬酸氯馬斯汀可促進少突膠質細胞成熟防止4EP+小鼠行為改變；使用咪康唑誘導髓鞘形成也可以改善4EP+小鼠的焦慮樣行為，表明4EP(S)通過影響少突膠質細胞成熟調節小鼠的焦慮樣行為。

▲ 圖4. 4EP(S) 改變髓鞘形成和誘導焦慮樣行為

小結

本文研究者發現了代謝物4EP(S)的生物合成途徑，酪氨酸或其他膳食來源物質可作為前體被腸道菌群代謝成4EP；4EP在宿主磺基轉移酶作用下被轉化為4EPS，隨后進入大腦，改變特定大腦區域的激活和連接，并破壞大腦中少突膠質細胞的成熟和髓鞘形成模式；腸道暴露于4EP會誘導小鼠產生多種情緒化行為。4EP(S)如何導致少突膠質細胞成熟和髓鞘化的變化以及如何影響行為等問題有待進一步明確。

參考文獻

A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 2022

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