非酒精性脂肪肝 (NAFLD)的特征為肝臟中脂滴沉積，但無明顯的酒精攝入和繼發性原因，現已被定義為代謝功能障礙相關的脂肪性肝病 (MAFLD)。MAFLD目前包括肝脂肪變性 (HS) 和非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)，最終導致肝纖維化和肝硬化。MAFLD發病機制復雜，且與代謝綜合征、肥胖和 2 型糖尿病 (T2D) 密切相關。來自英國諾丁漢大學的科研團隊通過對MAFLD患者進行多組學分析，獲得了不同程度HS患者的特征，并通過綜合分析破譯了早期MAFLD的發病機制，相關成果發表于《Advanced Science》。

HS與臨床指標✦

納入56名患有不同程度HS的超重和肥胖受試者(BMI>28.8kg·m-2)，排除攜帶PNPLA3 I148M (I148M為純合子)的患者。將受試者分為四個不同組：i) 10名無脂肪變性 (HS<5.5%)，ii) 14名輕度脂肪變性 (5.5%≤HS<8%)，iii) 20名中度脂肪變性 (8.0%≤HS<16.5%)，和iv) 12名重度脂肪變性 (HS≥16.5%)。通過測量臨床指標對這些受試者進行表型分析。結果顯示，與無脂肪變性的受試者相比，重度和中度脂肪變性受試者的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、尿酸（尿酸鹽）和γ-谷氨酰轉移酶（GGT）水平顯著升高，這些變量在輕度脂肪變性受試者中也呈現升高趨勢。同時發現，與無脂肪變性的受試者相比，重度脂肪變性受試者的臨床變量（包括白蛋白、肌酐、肌酸激酶等）顯著升高，且在輕度、中度受試者中也呈現升高趨勢。基于上述臨床變量的主成分分析（PCA）結果顯示，無、輕度、中度和重度脂肪變性之間呈現明顯的分離趨勢。

▲圖1. HS與臨床和物理變量之間的關系

MAFLD患者腸道和口腔菌群失調✦

對唾液和糞便樣本進行宏基因組分析，獲得輕度、中度及重度脂肪酸變性組與無脂肪變性組間的口腔及腸道差異物種，并通過每個HS組與無脂肪變性組之間的Log2倍數變化 (Log2FC)對不同HS組間發生顯著變化的物種進行線性回歸分析。結果顯示，腸道菌群中的差異物種變化在輕度和中度脂肪變性組之間以及在中度和重度脂肪變性組之間呈現正相關，而在輕度和重度脂肪變性組之間呈現負相關，提示當發展到重度脂肪變性階段時，腸道菌群組成存在較大差異。而口腔菌群中差異的物種在不同組之間均呈現正相關，表明不同組之間口腔菌群組成的變化相似。

基于腸道菌群差異分析結果表明，與無脂肪變性組相比，輕度脂肪變性組中Bacteroidetes、Proteobacteria、lenisphaela和Firmicutes4個門水平下的一些物種豐度顯著降低；，而中度脂肪變性組中Firmicutes和Bacteroidetes2個門水平的物種豐度顯著升高，只有Firmicutes bacterium CAG 95豐度顯著降低；重度脂肪變性組中Actinobacteria、Bacteroidetes、Lentisphaerae、Firmicutes和Proteobacteria這幾個門水平的物種豐度顯著降低；中度和重度脂肪變性組的Firmicutes bacterium CAG 95的豐度均顯著降低。

基于口腔菌群差異分析結果表明，與無脂肪變性組相比，輕度組中Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria這幾個門水平的一些物種豐度顯著降低；中度組中Firmicutes中的一些物種豐度升高，Proteobacteria中的一些物種豐度降低；重度脂肪變性組中Bacteroidetes和Proteobacteria中的一些物種豐度顯著降低，而Actinobacteria中的一些物種豐度顯著升高；中度和重度脂肪變性組中Haemophilus sputorum的豐度顯著降低。

隨著脂肪變性越來越嚴重，腸道菌群組成中Bacteroidia是富集程度最高的菌群，Clostridia是富集程度排名第二的菌群。與無脂肪變性組相比，重度脂肪變性組中Clostridia/Bacteroidia比值顯著降低，Firmicutes和Negativicutes的相對豐度降低， Negativicutes的豐度升高。

▲圖2. MAFLD患者腸道和口腔菌群失調

宏基因組數據與臨床指標關聯分析✦

在中度和重度脂肪變性組中，腸道和口腔菌群的物種豐度與顯著改變的臨床變量之間的相關性分析顯示，存在明顯的物種豐度減少和增加的簇。且腸道菌群中Firmicutes豐度與HS、AST、ALT和尿酸水平呈顯著負相關。口腔菌群中Campylobacter concisus和Capnocytophaga granulosa的豐度與HS、ALT和AST水平呈負相關，而Eikenella sp NML130454和Actinomyces johnsonii則與以上指標呈正相關，而Haemophilus與HS和ALT水平呈顯著負相關。

口腔菌群與腸道菌群的相關性分析結果表明，口腔菌群中Actinomyces sp ICM47的豐度與產丁酸菌Eubacterium rectale和Roseburia faecis呈負相關，而腸道菌群中的 Faecalibacterium prausnitzi和Roseburia gutis的豐度與口腔菌群中Prevotella sp oral taxon 306的豐度呈負相關；腸道菌群中Faecalibacterium prausnitzii的豐度與口腔菌群中Haemophilus parainfluenzae, Neisseria mucosa和Prevotella copri的豐度呈正相關。

▲圖3. 宏基因組學數據與臨床參數關聯分析

MAFLD患者血漿代謝組學變化✦

對56名受試者的血漿樣本進行非靶向代謝組學分析，共獲得928種代謝物，且與無脂肪變性組相比，輕度、中度和重度脂肪變性組中分別有43、79和129種代謝物存在顯著差異。在這些代謝物中，分別有17、52和66種與脂質代謝有關，剩余26、27和63種代謝物與其他代謝通路有關（如氨基酸、NAD+和抗氧化代謝）。在這些非脂質代謝物中，分別有16種、14種、43種代謝物存在特異性顯著差異。

同時發現，與無脂肪變性相比，血紅素的血漿水平僅在輕度脂肪變性組中顯著升高，據報道血紅素合成的改變可能與MAFLD的氧化應激增加有關。還發現膽紅素的降解產物在重度脂肪變性組中顯著降低；可促進炎癥的N-乙酰犬尿氨酸僅在輕度組升高。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）合成的前體—喹啉酸，僅在中度脂肪變性組中顯著降低。據報道，喹啉酸的下調與動物的MAFLD有關，而NAD+的代謝改變與人類的MAFLD有關。還發現N，N，N-三甲基-5-氨基戊酸鹽（TMAVA）在中度脂肪變性組中顯著升高在組，而絲氨酸、N-乙酰甘氨酸及甘氨酸結合代謝物的水平僅在重度脂肪變性組中顯著降低。所有膽紅素降解產物僅在重度脂肪變性組中顯著降低。已報道重度脂肪變性組中膽紅素可以起到抗氧化劑的作用，減少HS的積累。另一方面，色氨酸、賴氨酸和尿酸代謝相關代謝物、尿酸和黃嘌呤在重度脂肪變性組中顯著升高；還發現與尿素循環相關的N，N，N-三甲基丙氨酰脯氨酸甜菜堿（TMAP）在重度脂肪變性組中顯著升高，這與之前的研究一致，即MAFLD患者的血漿尿酸水平與HS顯著相關。無脂肪變性組相比，重度和中度組中半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物（一種谷胱甘肽和半胱氨酸結合物）水平顯著降低；三個脂肪變性組的血漿3-羥基異丁酸（3-HIB）、氧化半胱氨酸甘氨酸水平顯著升高，5,6-二氫尿嘧啶水平顯著降低。

▲圖4. MAFLD患者血漿代謝組學變化

血漿代謝物與表型關聯分析✦

對五個臨床指標（包括肝臟脂肪、尿酸、ALT、AST和GGT）的血漿水平與代謝物血漿水平進行相關性分析， 結果表明，這些臨床變量與TMAP和BCAA及其結合物（包括亮氨酸、異亮氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸、γ-谷氨酰異亮氨酸、γ-谷氨酰纈氨酸、3-甲基-2-氧代戊酸和N-乙酰肌肽）的血漿水平呈正相關。ALT、AST和GGT水平與血漿犬尿氨酸水平呈正相關。此外，血漿尿酸水平與這五個臨床指標呈顯著正相關；而血漿半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物水平與這五個臨床指標呈顯著負相關。血漿17α-羥基孕烯醇酮3-硫酸鹽和5α-孕烯醇酮-3β，20α-單硫酸二醇水平與HS、ALT、AST和GGT水平呈顯著負相關。血漿代謝水平差異可用于提示HS，以及MAFLD患者的治療效果。

MAFLD患者血漿的炎癥蛋白質組學變化✦

通過蛋白質組分析平臺鄰位延伸分析（PEA）測量炎癥蛋白標記物的血漿水平。結果顯示，與非脂肪變性組相比，CDCP1的血漿水平在輕度脂肪變性組顯著降低，在重度脂肪變性組顯著升高，而其他大多數蛋白質在所有脂肪變性組中的變化趨勢一致。且TNFRSF9血漿水平在三個脂肪變性組均顯著降低；ST1A1、IFN-γ和CCL23水平僅在輕度脂肪變性組降低。CX3CL1、TNF、CD40、CSF-1和TWEAK水平在中度脂肪變性組中降低；NT-3、CCL20、CCL4、CCL3、LIF-R、OPG和HGF僅在重度脂肪變性組中升高，而SCF僅在重度脂肪變性組中降低。然后對五個臨床指標與炎癥相關蛋白血漿水平的進行相關性分析，確定了兩個主要簇，這些臨床指標分別與第一和第二簇中至少一種炎癥相關蛋白呈負相關和正相關。

▲圖5. 血漿代謝組與患者表型關系及患者血漿的炎癥蛋白質組學變化

基于多組學數據的HS預測✦

通過表型組學、代謝組學、蛋白質組學和口腔/腸道宏基因組學數據分析，確定了在56名受試者中具有區分不同HS程度組間的差異特征。對單組/多組數據進行隨機森林算法分析發現與HS相關的關鍵特征。首先，通過單一組學分析發現，腸道宏基因組數據是預測脂肪變性程度的最佳數據集，準確率> 70%（曲線下面積（AUC）：0.90）。而炎癥蛋白質組學數據的預測效能最差，準確率僅為35.3%（AUC：0.72）。接下來，測試了單一組學數據集中的前五或前十個特征，并嘗試進行不同組合，結果顯示臨床指標（五個變量）、代謝組學（十個變量）和蛋白質組學（五個變量）中的各種重要特征產生了64.7%的準確率（AUC:0.92），而添加腸道和口腔宏基因組學（各十個重要特征）后，在預測脂肪變性程度方面的最高準確率為94.1%（AUC:0.951）。并在22名受試者的隨訪隊列中進行驗證，通過添加臨床指標（五個變量）、代謝組學（十個變量）、蛋白質組學（五個變量）以及腸道和口腔宏基因組學（各十個重要特征）中的重要特征，模型準確率達到82.7%（AUC:0.843）。通過在發現數據集中添加臨床、代謝組學、蛋白質組學、腸道宏基因組學和口腔宏基因組學數據中的前五大特征，對HS的預測效能最高（AUC:1.0）。且在隨訪隊列進行了驗證獲得了更高的預測效能（AUC：0.886）。

臨床指標（ALT、AST、uric acid、insulin和 GGT）、代謝組學（N,N-二甲基-5-氨基戊酸、5-（半乳糖基羥基）-L-賴氨酸、酚葡糖苷酸、N,N-二甲基丙氨酸 和 N-甲基牛磺酸）、蛋白質組學（CDCP1、CD244、LIF-R、FGF-21和CXCL9）、腸道宏基因組學（Barnesiella intestinihominis、Dorea longicatena、Prevotella sp CAG 279, Roseburia intestinalis和Ruminococcus bromii）和口腔宏基因組學（Actinomyces naeslundii, Veillonella infantium,Treponema vincentii, Campylobacter showae和Campylobacter concisus）中用于預測HS的前五大特征可被視為MAFLD的候選生物標記物。在本研究中，還發現腸道中的Barnesiella intestinihominis、Dorea longicatena和Ruminococcus bromii和口腔中的Campylobacter concisus和Veillonella infantium的豐度與HS顯著相關，且其豐度與血漿代謝物水平和炎癥蛋白質組學水平顯著相關。

隨后生成一個綜合多組學網絡，用于顯示其他組學數據集內和其他組學數據集間的不同分析物之間的關系。對來自上述組學數據的所有分析物之間，通過FDR<0.05的邊緣過濾，產生一個具有1032個節點和17536個邊（3.3%網絡密度）的相對稀疏網絡。對網絡進行中心性分析發現，前20個連接最多的節點與脂質代謝有關，例如神經酰胺、鞘磷脂、甘油二酯和磷脂相關的子通路。同時發現與脂質相關的臨床變量是臨床變量（總膽固醇、GGT、LDL和TG水平）的最重要節點。

▲圖6. 基于多組學數據的HS預測

多組學數據生物網絡的綜合分析✦

通過Spearman相關性進行綜合多組學網絡分析以探究多組學數據集內部及數據集之間的重要聯系。對網絡進行中心性分析發現，前20個連接最多的節點與脂質代謝有關，例如神經酰胺、鞘磷脂、甘油二酯和磷脂相關的通路；與脂質相關的臨床變量是臨床變量的最重要節點。與細胞因子-細胞因子受體相互作用相關的 STAMBP、TNFSF14、SIRT2、CXCL5、CXCL1和CD40，以及與多個信號通路相關的NF-kappa B、TNF 和 IL-17是炎癥蛋白質組學中的最重要節點。隨后進行聚類分析獲得4個簇。在簇-0 中，與氨基酸代謝相關的代謝物位于首位；而簇-1以磷脂、碳水化合物和牛磺酸代謝為主；在簇-2中，包含大多數與脂質相關的代謝物和臨床變量，使該簇成為HS中的候選中心變量；簇-3主要與脂肪酸代謝相關。

從多組學隨機森林模型中提取特征并僅篩選顯著改變的分析物，從而最終獲得九種重要特征：ALT、AST、GGT、尿酸、CDCP1、LIF-R、Dorea longicatena (腸道)、Ruminococcus bromii (腸道），Porphyromonas endodontalis（口腔）。通過檢索這些特征的第一相鄰特征以及HS的子網絡，結果表明，其主要集中于脂質代謝物、γ-谷氨酰氨基酸、BCAA 代謝物、脂肪酸代謝（肉堿衍生物）和與HS顯著相關的谷胱甘肽相關代謝物。

構建一個以宏基因組學為中心的網絡，包括來自隨機森林分析的關鍵特征，以及至少五個樣本中豐度>1%的所有菌群物種。與之前的方法類似，結果發現，HS與腸道菌群中的Victivallis vadensis、Firmicutes bacterium CAG 95、Slackia isoflavoniconvertens和Bilophila wadsworthia以及口腔菌群中Porphyromonas endodontalis和Haemophilus sputorum的豐度呈顯著負相關。而腸道中Slackia isoflavoniconvertens和Bilophila wadsworthia的豐度也與HS、AST和GGT水平呈負相關。腸道中的Streptococcus salivarius的豐度與 ALT、AST 和 GGT 水平呈負相關。另一方面，Dorea longicatena的豐度與ALT和 AST水平呈負相關，與Bacteroidales和Clostridiales呈正相關。總之，多組學數據的綜合網絡分析強化了單一組學分析的結果，并增加了識別與HS相關的關鍵特征的能力。此外，它揭示了不同組學數據內部和數據之間的功能關系。

▲圖7. 多組學數據生物網絡的綜合分析

小結✦

本研究通過對不同程度肝脂肪變性（HS）的MAFLD患者進行多組學分析，鑒定出與肝脂肪變性相關的口腔和腸道菌群失調特征，揭示基于全身代謝和炎癥過程的宿主-微生物群相互作用。并通過網絡分析對多組學數據進行整合，確定HS的關鍵特征，基于這些特征構建診斷模型，并在隨訪隊列進行驗證。

參考文獻✦

Multiomics Analysis Reveals the Impact of Microbiota on Host Metabolism in Hepatic Steatosis. Advanced Science. 2022.

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