蛋白水解靶向嵌合分子PROTAC對蛋白的降解機制
PROTAC 全稱為 proteolysis-targeting chimeras (蛋白水解靶向嵌合分子)，是一種雜合雙功能小分子化合物，由三部分組成：靶蛋白配體、連接子 Linker、和 E3 連接酶配體，結構中兩個配體之間通過 linker 相連，從而形成“三體”聚合物——靶蛋白配體-Linker-E3 配體。它通過將目標靶蛋白和細胞內的 E3 泛素連接酶的距離拉近，利用泛素-蛋白酶體途徑特異性的降解靶蛋白。
PROTAC 對蛋白的降解是事件驅動機制，它的兩端能分別連接相應的配體與 E3 連接酶，所以在濃度上存在一個最佳活性濃度，在此濃度兩邊由于 PROTAC 與蛋白的結合產生的過量或不足的游離蛋白都會導致降解效能的下降。
PROTAC 分子在進入細胞后，目標蛋白配體可特異性地與相應的靶蛋白結合，另一端可募集 E3 連接酶，從而形成“三體”聚合物；E3 連接酶可介導泛素結合酶 E2 對目標蛋白配體泛素化。被泛素標記的目標蛋白可被蛋白酶體識別并降解。
傳統小分子需要知曉靶蛋白的內在作用位點和機制，而 PROTAC 則不用重視靶蛋白本身機制，無需競爭性位點，只要結合上，直接將靶蛋白泛素化標記后降解。此外，由于它的機制特殊，僅需少量就可發揮藥效，用量常常是納摩爾級別，也正因為如此，它在安全性和活性評價方面需要特殊的方法。
最后，常規 PROTAC 藥物也存在溶解性和透膜性等問題。下圖是兩者優缺點的詳細比較。
■ E3 連接酶配體
E3 連接酶可以分成 RING、HECT、RBR 等家族，每個家族下又有其他分型。目前已知的 E3連接酶約有 600 多種，但在 PROTAC 中常用配體的相關 E3 連接酶只有 CRBN、VHL、IAP、MDM2 等四種，此外還有 DCF15、RNF114、DCAF16、KEAP1、FEM1B 等僅有少數配體報導的E3連接酶。下圖是常見的 E3 連接酶配體及其案例。
圖 3. 常見的 E3 連接酶及其配體[6]
■ 靶蛋白配體
泛素-蛋白酶體途徑可以針對細胞周期蛋白、紡錘體相關蛋白、細胞表面受體、轉錄因子、腫瘤抑制因子、癌基因產物以及應激條件下胞內變性蛋白及異常蛋白等靶蛋白進行降解。而目前對 PROTAC 配體的選擇上大部分還只是基于已知的抑制劑/激動劑，靶點也多為癌癥相關蛋白。這表明對 PROTAC 的研究還處在早期階段，靶蛋白配體可以采用虛擬篩選與高通量篩選的方法不考慮競爭結合，而神經退行性疾病、自免性疾病等相關蛋白也有待開發。
2021 年，Nature Reviews Drug Discovery 雜志報導了一篇利用 PROTACtability 方法評價蛋白靶點的可 PROTAC 性的文章，文章最后值得 PROTAC 化的靶點包括了激酶 (MEK、KRAS、CDK 和 Bcr/Abl)、轉錄因子 (如 p53、STAT、RAR、ER 和 AR)、表觀遺傳因子 (如 HDAC 和 BET 溴結構域)和 E3 連接酶本身 (如 MDM2) 等。
圖 4. PROTACability 靶點評價[7]
■ 連接子 Linker
Linker 是連接 E3 連接酶配體與靶蛋白配體的連接單元。鏈長是 Linker 最重要的參數，鏈長過短會因空間碰撞而阻礙三元配合物形成，鏈長過長則會帶來結合熵增加。
常見的 Linker 為 PEG 或者直鏈烷烴等，連接常用酯化、酰胺化、Click 反應等構建。PROTAC 分子的后期改造則是在此基礎上，通過改變鏈長、引入芳基增加疏水性及剛性、增加一條連接鏈限制分子扭轉、利用光轉換基團事先屏蔽活性位點等方法來提高分子的總體性能。不同的連接子基元也有相應的特點，如下圖所示：
圖 5. Linker 的不同基元及優缺點[10]
除了上述 Linker 分子，也有研究者將 Linker 設計成可以連接兩個靶蛋白配體的結構，其中關鍵在于中間三功能氨基酸 (蘇氨酸、絲氨酸等) 的引入。如在Rational Design and Synthesis of Novel Dual PROTACs for Simultaneous Degradation of EGFR and PARP 一文中，研究者將 EGFR 配體、PARP 配體和 E3 連接酶通過常見的烷基鏈與中間的樞紐氨基酸相連，并在體外活性測試中驗證了該分子具有 EGFR 與 PARP 的雙重降解活性。
圖 6. 雙功能分子 PROTAC[10]
PROTAC 技術目前發展的如火如荼，它能一力降十般解決許多靶蛋白不成藥的問題，但是溶解性、透膜性和選擇性等問題的存在又使它的開發過程如履薄冰。解決這些問題可能需要新的 E3 連接酶配體的發現，也可能需要 Linker 分子基元的創新，恰逢這個時代，這些既是機遇也是挑戰。
而在 PROTAC 之外，還有許多類似的技術，比如降解膜蛋白和胞吞蛋白的 LYTAC 、AUTAC、ATTEC 等，利用同樣的泛素-蛋白酶體途徑降解 IKZF 蛋白的“分子膠”等，基于抗體偶聯藥物技術將 PROTAC 連在抗體上的 PAC 藥物等，也為 PROTAC 技術的發展提供了新的開發方向。
無論前方如何，路總是人走出來的，更何況可以模塊化構建的 PROTAC 分子，小分子作為藥物領域的一大前沿技術，大大縮短了小分子藥物的發現與設計周期。
■ MCE 可提供的產品與服務
MCE 是全球前沿的科研化學品和生物活性化合物供應商，我們配備強大的技術人才團隊和國際先進的設備，對于 PROTAC 產品，我們擁有豐富的研發和生產經驗。
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E3 ligase ligand linker conjugate |
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N-Descyclopropanecarbaldehyde Olaparib N-Descyclopropanecarbaldehyde Olaparib 是含有 DOTA 的奧拉帕尼的類似物，可用于合成新型靶向 EGFR 和 PARP 的雙靶點 PROTAC，DP-C-4。 |
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是一種合成的 E3 連接酶配體-Linker 偶聯物，包含基于 Pomalidomide 的 Cereblon 配體和 1個 Linker。 |
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Target protein ligand linker conjugate |
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包含靶蛋白 FAK 配體和 PROTAC linker，可募集 E3 連接酶 (如 VHL，CRBN，MDM2 和 IAP 等類型)。FAK ligand-Linker Conjugate 1 可廣泛用于 PROTAC 介導的蛋白降解。 |
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K-Ras ligand-Linker Conjugate 4 包含靶蛋白 K-Ras 配體和 PROTAC linker，可募集E3連接酶 (如VHL，CRBN，MDM2 和 IAP 等類型)；可用于合成 PROTAC K-Ras Degrader-1 (HY-129523)。 |
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PROTAC |
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不可逆的選擇性 BTK 抑制劑，用于合成一系列 PROTAC 分子，如 P13I。 |
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是一種基于 PROTAC 技術的有效的 K-Ras 降解劑，在 SW1573 中對 K-Ras 降解率 ≥70%。 |
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SNIPER |
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由 Dasatinib (ABL 抑制劑) 通過 Linker 與 Bestatin (cIAP1 配體)組合而成，可有效降解 BCR-ABL 蛋白。 |
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PROTAC-linker Conjugate for PAC |
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PROTAC BRD4 Degrader-5-CO-PEG3-N3 是一種用于 PAC 的 PROTAC-linker 偶聯物，包含 BRD4 降解劑 GNE-987 和 3 個 PEG 的 Linker。 |
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PROTAC BRD4 degrader for PAC-1 是一種用于 PAC 的 PROTAC-linker 偶聯物，包含嵌合體 BET 降解劑 GNE-987 和含二硫化物的 Linker。 |
MCE 的所有產品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產品和服務。
參考文獻
1. Ostrem JM, Peters U, Sos ML, Wells JA, Shokat KM. K-Ras(G12C) inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions. Nature. 2013 Nov 28;503(7477):548-51.
2. News: Arvinas and Pfizer Announce Global Collaboration to Develop and Commercialize PROTAC® Protein Degrader ARV-471.
3. Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019 Jan;37(1):21-30.
4. Pettersson M, Crews CM. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) - Past, present and future. Drug Discov Today Technol. 2019 Apr;31:15-27.
5. Dale B, Cheng M, Park KS, Kaniskan HÜ, Xiong Y, Jin J. Advancing targeted protein degradation for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2021 Jun 15;1-17.
6. Schneider M, Radoux CJ, Hercules A, Ochoa D, Dunham I, Zalmas LP, Hessler G, Ruf S, Shanmugasundaram V, Hann MM, Thomas PJ, Queisser MA, Benowitz AB, Brown K, Leach AR. The PROTACtable genome. Nat Rev Drug Discov. 2021 Jul 20.
7. Morreale FE, Walden H. Types of Ubiquitin Ligases. Cell. 2016 Mar 24; 165(1): 248-248.e1.
8. Bricelj A, Steinebach C, Kuchta R, Gütschow M, Sosič I. E3 Ligase Ligands in Successful PROTACs: An Overview of Syntheses and Linker Attachment Points. Front Chem. 2021 Jul 5;9:707317.
9. Bemis TA, La Clair JJ, Burkart MD. Unraveling the Role of Linker Design in Proteolysis Targeting Chimeras. J Med Chem. 2021 Jun 24;64(12):8042-8052.
10. Troup RI, Fallan C, Baud MGJ. Current strategies for the design of PROTAC linkers: a critical review. Explor Target Antitumor Ther. 2020;1:273-312.
