線粒體疾病是線粒體基因組（mtDNA）發生基因突變所導致的一類遺傳疾病, 僅通過雌性種系傳播。通常，細胞中超過60%的線粒體DNA發生突變就會導致疾病，并且一個人的線粒體DNA突變越多，其疾病就越嚴重，線粒體疾病目前是不可治愈的。

▲圖源：網絡（侵刪）

目前核移植（NT），也稱為線粒體捐贈，作為一種預防線粒體疾病從患病母親傳給其后代的戰略而受到了越來越多的關注。但由于核移植中含有少量細胞質來源的mtDNA，介導受體中mtDNA異質性改變且伴有擴增，因此需要對mtDNA突變負荷進行準確定量，現用NGS測序方法局限性在于成本較高、耗時較長、數據處理復雜且信噪比較低。

Leber遺傳性視神經病（LHON）最常見的母系遺傳性線粒體疾病，比利時根特大學生物系專家團利用數字PCR(dPCR)平臺對LHON相關m.11778 G＞A突變位點進行檢測，并和NGS方法進行對比，探討數字PCR在mtDNA異質性定量中的適用性。研究成果發表在知名期刊《Clinical Chemistry》上。

檢測樣本信息:

為了評估dPCR在異質性評估中的適用性，共設置了3種類型的樣品：（i）具有很高突變負荷的患者樣品13個；（ii）由健康志愿者捐贈的同質野生型樣品3個；（iii）經過NT處理的樣品，由于mtDNA殘留而攜帶低突變負荷，共6個樣本。

檢測方法：

通過處理，將樣品突變負荷范圍設置在50％至0.01％，進行分析驗證。

實驗結論:

☑  在dPCR和NGS結果上觀察到的突變率具有良好的一致性。

☑與NGS相比，dPCR具有更低的背景噪聲。使用naica^®微滴芯片數字PCR系統，非患者樣本中的突變等位基因沒有陽性信號，符合預期。

☑  和dPCR結果相比，在NGS結果中幾乎所有異質樣品的次要等位基因頻率都被高估，初步猜測NGS實驗流程中可能引入了錯誤序列，經過PCR擴增改變次要等位基因頻率。

☑  相較于NGS，數字PCR成本低、操作簡便、結果直觀、更適用于低頻突變檢測。

☑  數字PCR方法適合用于核移植后線粒體異質性定量檢測。

▲naica^®微滴芯片數字PCR系統檢測不同mtDNA樣本二維圖（FAM-突變型，VIC-野生型）

左上：高突變負荷患者樣本；右上：野生型樣本；左下：NT后異質性樣本；右下：NTC

▲Bland-Altman PLOT評估naica^®微滴芯片數字PCR系統檢測結果和NGS結果的一致性

最后，文章conclusion給出-數字PCR具有更多優勢，適用于核移植后線粒體的異質性評估：

▲ 圖片來源：原文第8頁

期刊介紹：

naica^®微滴芯片數字PCR系統

法國Stilla Technologies公司的naica^®微滴芯片數字PCR系統在進行核酸檢測時具有獨特的優勢。該系統利用cutting-edge微流體創新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作為數字PCR過程的耗材。樣品通過毛細通道網格以30,000個微滴的形式進入2D芯片中。3色熒光檢測儀器，整個流程只需要2.5小時，并可進行數據的質控和結果追溯分析，獲得的數據真實可靠。

naica^®六通道微滴芯片數字PCR系統

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數字PCR系統，源于Crystal微滴芯片數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數濃度。