qPCR實驗的重要影響因素-抑制劑的使用與檢測方法

瀏覽次數：4465　發布日期：2020-12-25　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

在決定實時熒光定量PCR檢測靈敏度、準確性和可靠性的眾多因素中，模板質量是決定重復性和生物學相關性的重要因素之一。諸多報告中也描述了生物樣品中常見的抑制成分會導致qPCR分析靈敏度和動力學的顯著降低。

如何檢測抑制劑：

多種方法可用于評估生物樣品中是否存在抑制劑。常用方法是通過連續稀釋樣品來評估樣品的PCR效率，PCR效率的高低一定程度上反映出樣品質量的好壞。一個高效的PCR反應要求擴增效率在90%-110%之間，當擴增效率＞110%或＜90%，無論是相對定量還是絕對定量其最終結果都會不準確。那么怎么來判斷是由于抑制劑引起的擴增效率異常呢？如圖1所示，通過標準曲線的狀態判斷，當原液的數據點位于標曲上方（紅色箭頭），則極有可能是樣本抑制劑抑制PCR反應導致Cq值偏大。

內部擴增控制（IACs）是一種與目標核酸共純化和共擴增的方法，可用來檢測抑制劑和指示加工過程中的模板丟失。IACs可包裝在噬菌體外殼中，也可以是包含引物結合序列和探針檢測序列的單鏈寡核苷酸。在熒光信號采集過程中，探針結合位點的部分不匹配阻止了與IACs雜交，隨后可對熔解曲線進行分析，用以區分IACs和目標擴增子。IACs將是檢測病原體的優質方案，但這種方法不適用于細胞mRNA定量，因為考慮為每個單一mRNA設計模擬物是不現實的。

另外，也可以通過使用外源性對照來測試抑制劑，也稱為Spikes。該方法無論是在其構造技術的復雜性方面，還是在分析之后與它們的準確檢測相關的額外工作方面，相對都是比較簡單的。Spikes可以是RNA也可以是DNA分子，這取決于靶標類型。mRNA表達分析首選RNA Spikes，DNA靶標分析首選DNA Spikes。Spikes通常是幾千個堿基/堿基對異型序列，所以不會與任何已知目標交叉反應。

抑制劑類型：

抑制劑可以是核酸提取過程中使用的試劑，也可以是從生物樣品中提取的成分。抑制劑的影響，較好的情況是抑制劑會產生不準確的定量結果；最壞的情況是高度抑制會產生假陰性結果。常見的抑制劑類型如下：

1）樣品本身的成分：許多生物樣品本身就含有嚴重抑制逆轉錄和PCR反應的成分，如血液中的血紅蛋白、免疫球蛋白G，肌肉中的肌紅蛋白、膽鹽、腐殖酸、尿素和膠原蛋白，植物中的多糖多酚等。

2）提取和純化試劑的成分：許多用于純化核酸的試劑，如苯酚、氯仿、硫氰酸胍、鹽酸胍、乙二胺四乙酸、二甲基亞砜、十二烷基硫酸鈉、噻唑、三唑和核糖核酸等。

如何降低抑制劑的影響：

當樣本中存在抑制劑，高濃度模板中抑制劑濃度較高，對PCR反應的影響較大。低濃度模板由于稀釋使得抑制劑濃度有所下降，抑制劑的抑制作用也相應降低。如果是樣品本身的成分，可對模板進行稀釋，或者進一步純化，又或者改進提取方法來降低抑制劑的干擾。如果提取和純化試劑的成分，其本身就是最有效的逆轉錄和聚合酶鏈反應的抑制劑，因此需要在提取和純化過程中注意對試劑成分的去除，防治污染模板。

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