PRIMO 各種應用的FAQ匯總
森西萬通科技（北京）有限公司
 
注：以下內容來自：
https://www.alveolelab.com/resources-support-center/faq/
 

• 用PRIMO進行光照圖案化（Photopatterning）的FAQ

 
注：以下FAQ內容來源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/photopatterning-with-primo/
 
問1：與其他微圖案化（Micropatterning）技術相比，PRIMO的光照圖案化（Photopatterning）技術的優勢有哪些？
答：PRIMO的解決方案給研究者提供實驗操作的完全的自由度和全面的控制，使其可以很容易的優化實驗條件。PRIMO可以快速建立任意形狀的蛋白圖案，以便精確的匹配或重疊不同的蛋白（可以無限制的使用多達3種蛋白，取決于使用的蛋白的種類和它們的相互作用），并控制吸附在基質上的局部的蛋白的密度。
 
問2：PRIMO可用于哪些應用？
答：（1）基質上的2D光圖案化（2D photopatterning on substrate）；
（2）3D微結構上的光圖案化（Photopatterning on 3D microstructures）；
（3）微制造（Microfabrication），如微流道芯片(microfluidic chip)制造。
 
問3：用PRIMO解決方案創建一個蛋白圖案要多少時間？
答：創建一個圖案（不包括圖案設計步驟）的總體時間大概在10-15min。光照的時間各不相同，并且必須根據投射的圖案和使用的物鏡進行優化。在每次用UV照射并降解抗污聚合物涂層（anti-fouling polymer）（抗粘附）的步驟之后，都需要大概5min以便蛋白能吸附在圖案上（時間隨著放置在基質上的蛋白濃度的不同而變化）。
 
問4：細胞圖案能穩定多久？
答：細胞圖案的穩定的時間長度取決于使用的基質和培養的細胞類型。在一定的條件下，細胞能粘附在蛋白圖案上長達2周。我們的研發團隊會定期開發一些新的實驗步驟供我們的用戶選擇。
 
問5：用PRIMO能否在水凝膠上打印出蛋白圖案？
答：我們建議采取轉移的技術（transfer technique），用PRIMO在載玻片上打印蛋白圖案，再將載玻片放置在水凝膠上然后移除。如果用UV照射將蛋白光圖案化到水凝膠上，往往會改變水凝膠的物理特性，然后改變一開始設定的實驗條件。
 
問6：載玻片能提前包被嗎？
答：我們推薦在同一天進行蛋白包被。然而，我們的研發團隊也針對特定的基質定期開發新的實驗方案，使保存用蛋白包被好的載玻片以供后用成為可能。
 
問7：為什么表面處理對于光照圖案法很重要？
答：光照圖案法是一個“減法”技術。它的首要目標是使用抗污聚合物包被基質，這樣可以防止分子和細胞的粘附。然后在UV光和光活化試劑（PLPP）的共同作用下，使用PRIMO系統來局部降解這個抗粘附表層。
 
問8：PRIMO能允許在無菌的條件下進行實驗嗎？
答：可以。用PRIMO操作的實驗可以在無菌的環境下進行，即使PRIMO儀器沒有設置在無菌的房間中。這時，我們推薦在生物安全柜（BSC）中進行所有的洗滌和培養步驟，然后將樣本放入一個封閉的培養板，然后放到PRIMO儀器的電動載物臺上。
 
問9：PRIMO能用來在3D結構上打印蛋白圖案嗎？
答：PRIMO可用來在各種表面上打印圖案，無論是否是平的、卷曲的或是有微結構的。例如，它可以將蛋白打印在微孔板的孔壁上，或PDMS的微柱上。可以按需提供這些內部數據。
 
問10：是否總是將光活化PLPP試劑和PRIMO配套使用？
答：PLPP可以加速光圖像化過程中，抗污聚合物的降解作用（只需幾秒鐘，而不是幾小時）。然而，使用SU8樹脂或NOA進行微制造（microfabrication）操作是不需要使用PLPP的，因為這些材料在PRIMO光波長（375nm）下是光敏感的。
 
問11：在基質上需要進行什么樣的抗污聚合物表面處理？
答：我們推薦使用PLL-PEG聚合物。我們定期開發新的實驗方法以促進表面包被層的穩定性。
 
問12：儀器的視野的深度有多少？
答：當使用20x物鏡時，激光穿透透明基質的視野的深度大概是200-300µm。
 
問13：儀器的分辨率有多少？
答：當使用20x物鏡時，在大概500x300µm的視野中，整個視野的分辨率是1.2µm。
 
問14：能做的圖案尺寸是多少？
答：PRIMO可以做任意尺寸的圖案，沒有大小限制。
 
問15：用PRIMO儀器哪些蛋白可以被圖案化？
答：我們的團隊和用戶使用超過10種不同的蛋白，包括：Fibrinogen-488、Fibrinogen‐647、Fibronectin、GFP、Neutravidin‐488、Neutravidin‐647、PLL‐PEG‐Biotin、Protein A‐647、Streptavidin，和初級、次級抗體。
 
問16：用PRIMO儀器，哪些基質可以用來進行蛋白的光圖像化操作？
答：PRIMO可用來對各種標準細胞培養基質進行圖案化，包括：PDMS、玻璃、塑料、NOA、SU8。我們的研發團隊也在定期測試和驗證新的基質。可以按需提供這些內部數據。
 
問17：用PRIMO進行微制造（Microfabrication）時，需要用到哪些光阻材料（Photoresist）？
答：所有在375nm下敏感的光阻材料都可以與PRIMO配套使用。我們的研發團隊主要用SU8光阻材料。
 

• PRIMO表面蛋白涂層法/微圖案法（micropatterning）進行Cryo-ET成像FAQ

 
注：以下FAQ內容來源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/primo-micropatterning-cryoet/
可參考：https://www.alveolelab.com/applications/cryo-em-grid-micropatterning/
 
問1：使用PRIMO準備Cryo-ET（冷凍電鏡）細胞樣本有什么不同？
答：PRIMO無掩膜微圖案系統（maskless micropatterning system）可以用來控制細胞的粘附。因此，它能保證多個細胞精確地定位在電鏡網格中（一般在網格的網眼正方形的中央）。而且，它能使您完全控制創建的微圖案的設計。正如我們用戶的研究論文所述，您可以控制細胞的形狀、極性、伸展性，以便進行：

• 生物力學研究；
• 幫助進行FIB milling操作；
• 保證重復性和更有效的cryo-ET成像。

 
問2：PRIMO微圖案法技術和所有電鏡網格（EM grids）都兼容嗎？
答：目前為止，我們檢測了不同的網格材料，我們可以確定PRIMO微圖案系統可以用于由碳膜、SiO2膜、硅氮化物膜（Silicon Nitride film）組成的網格，可以包含或不包含網眼。作為一種無掩膜微圖案法技術，它可以與所有經典的電鏡網格兼容。如果您想查證它是否和您的網格模型兼容，可以聯系我們。
 
問3：能否檢測我使用的透射電鏡網格（TEM grids）是否可使用PRIMO？
答：我們可以提供多種選擇來檢測PRIMO微圖案系統。您可以聯系我們來討論您的cryo-ET實驗，以便發現檢測PRIMO好的解決辦法。
 
問4：PRIMO系統可以透過膜進行微圖案化（micropatterning）嗎？
答：使用UV光穿透網格的膜進行微圖案設計是可行的，因為膜是透明的。如果您想在網眼中進行圖案設計，要確保放在電動載物臺（the motorized stage of the setup）上的網格是上下顛倒的（需要設計的膜的一面朝向物鏡一側）。
 
問5：我怎么確定我設計的微圖案處在電鏡網格的網眼范圍內？
答：Leonardo photopatterning software可以自動檢測電鏡網格的網眼。然后可以將微圖案定位于其中，并調整圖案尺寸使其完美契合。當然，Leonardo software也能進行預期結果的預覽，因此您能在進行微圖案化操作之前進行任何手動的修改。
 
問6：準備微圖案化的電鏡網格的過程需要多久？
答：每天您可生成5-15個微圖案化的電鏡網格，包括了從anti-fouling coating到protein incubation的所有步驟。
 
問7：操作電鏡網格是一個精細的步驟，看上去這個過程增加了更多的操作步驟，有沒有解決辦法呢？
答：的確，微圖案化的過程增加了更多的操作步驟，但是經過培訓，您將學會如何進行微圖案化操作而不會損壞電鏡網格。進一步而言，我們能開發特定的PDMS stencils（PDMS模板），可以將網格放置在蓋玻片（或其他物品）上，并在整個操作流程中保持其位置不動，以減少對網格的操作。
 
問8：用PRIMO系統在電鏡網格上得到的微圖案的分辨率是多少？
答：用PRIMO無掩膜微圖案系統在電鏡網格中得到的微圖案的分辨率是1.2µm，與在玻璃上得到的分辨率一致。
 
問9：能否在種植細胞之前保存已經進行微圖案化的網格，能保存多久？
答：可以，在吸附蛋白之前，準備好的電鏡網格可以在PBS溶液中保存一個月。
 
問10：PEG覆蓋層的厚度是多少？
答：PEG覆蓋層的厚度大概是5nm。
 
問11：在電鏡網格微圖案化之后，什么樣的細胞可以種植上去？
答：與在玻璃上進行微圖案化操作一樣，經典的哺乳動物貼壁細胞可以種植在TEM網格的微圖案上。目前為止，我們團隊和用戶已經成功操作的細胞包括：HeLa細胞、成纖維細胞（fibroblasts）、內皮細胞（epithelial cells）、MDCKⅡ、PtK1。
 
問12：微圖案化對細胞的狀態和功能的影響如何？
答：通過控制細胞粘附，微圖案化對它們的功能和行為有一定的影響。因為能建立更受控的、重現性更強的體外生化微環境，微圖案法能在更加生理相關的條件下研究活細胞（Thery, Journal of Cell Science,2010）
 
問13：有沒有利用你們的技術進行Cryo-ET研究的論文可供參考？
答：有的，您可以參考以下論文：
【1】M. Toro-Nahuelpan et.al., Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies, Nature Methods, 17, pp.50–54 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5 (Julia Mahamid's lab, EMBL)
【2】L. Engel et.al., Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies, Journal of Micromechanics and Microengineering, Volume 29, Number 11 (2019), https://doi.org/10.1088/1361-6439/ab419a (Beth Pruitt's lab, Stanford University, UC Santa Barbara)
【3】L. Engel et.al., Lattice micropatterning of electron microscopy grids for improved cellular cryo-electron tomography throughput, BioRxiv, posted Aug 31,2020, doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.30.272237 (Alexander Dunn's lab, Stanford University)
 

• PRIMO模組的FAQ

 
注：以下FAQ內容來源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/the-primo-module/
 
問1：PRIMO模塊里面內置的是什么類型的激光？
答：PRIMO模塊里包括的是375nm的紫外激光器（UV laser）。
 
問2：激光的功率是多少？
答：從管狀透鏡（tube lens）射出的激光的功率是6mW-8mW。在物鏡出口，激光的功率不同，取決于物鏡的選擇。當使用Nikon S Plan Fluor ELWD 20x/0.45參考物鏡時，激光的功率是：5mW-6mW，光強大概是29mW/mm2。
 
問3：PRIMO模塊的尺寸和重量是多少？
答：PRIMO模塊的尺寸是：46.2 x 32.5 x 7.2cm（長x寬x高）。它的重量是15kg，由安裝時提供的支架支撐。
 

• 專用的Leonardo軟件的FAQ

 
注：以下FAQ內容來源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/the-dedicated-leonardo-software/
 
問1：Leonardo軟件的特征是什么？
答：（1）相同的圖像的復制（設置排或列，調整間距）；
（2）重新排列連續的圖案，或將圖案排列在微結構上（預覽、旋轉）；
（3）圖像梯度的管理。
 
問2：圖像是如何畫上去的？
答：我們推薦用Inkscape軟件繪制圖像（開源的矢量設計軟件，類似Adobe Illustrator），可以在此獲得“使用指導”（user guide）。這個軟件可以創造像素大小的，或毫米大小的圖案，并按照Leonardo軟件可識別的不同的文件類型進行保存。
 
問3：可以使用什么類型的圖像文件？
答：要生成蛋白圖案的圖像文件格式必須是：tif格式（像素）或pdf格式（公制尺碼）。
 

• 光照圖案化平臺和試劑的FAQ

 
注：以下FAQ內容來源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/photopatterning-platform-and-reagents/
 
問1：什么樣的設備能安裝使用PRIMO模組？
答：（1）安裝有對焦維持系統（focus maintaining system）的倒置顯微鏡【1】：

• Nikon Ti-E 和 Ti-2
• Leica DMi8
• Olympus IX83

（2）有落射熒光系統（Epifluorescence system）；
（3）有電動X/Y載物臺；
（4）有照相機；
（5）有計算機；
（6）有等離子體反應器（又稱電漿機）（plasma reactor）和專用的泵(dedicated pump)【2】。
【1】按需可提供完整的顯微鏡配置；
【2】可根據實驗條件進行選擇。
 
問2：用PRIMO進行蛋白光圖案化時需要用到哪些耗材和試劑？
答：用到的耗材和試劑包括：
（1）PLPP溶液 1x；
（2）用玻璃或塑料制作的標準細胞培養基質（載玻片、蓋玻片、培養皿、3D設備，等），或預先用抗污聚合物處理過的基質；
（3）預先切割好的PDMS stencils（PDMS模板）（自由設計）【3】；
（4）石蠟封口膜（parafilm）；
（5）尖頭鑷子；
（6）微量移液器和適合的槍頭；
（7）在10mM HEPES pH=7.4中配置的PLL-PEG 1x溶液【4】；
（8）待粘附的蛋白的溶液，C=10-100µg/mL；
（9）PBS 1x溶液，pH=7.4。
【3】可選項；
【4】推薦在沒有預處理的基質上進行抗污表面處理。