α-Gal抗原定量檢測試劑盒（標準方法）說明書
 
使用目的：
本試劑盒適用于動物源性醫療器械、動物組織及其衍生物等相關樣本中α半乳糖基抗原（α-Gal）含量的定量檢測。
 
試劑盒原理：
本試劑盒完全按照行業標準《組織工程醫療器械產品 動物源性支架材料殘留α-Gal抗原檢測》中給出的方法，利用特異性抗-Gal抗體的酶聯免疫競爭法（競爭性ELISA或者ELISA抑制法）。即：在保證抗原抗體反應物中特異性抗體過量的前提下，首先標準曲線樣品及試驗樣品的α-Gal抗原與特異性抗體反應（消耗部分抗體）；然后用人工合成的Gal抗原（Gal-BSA）作為固相抗原，通過ELISA方法檢測第一次反應后上清液中的剩余抗體；進而可利用標準曲線計算待測物中的α-Gal抗原含量。
 
試劑盒組成:
試劑盒A (2~8℃保存)                    

1	Gal抗原包被板	8孔×12條
2	裂解液	50 ml×1瓶
3	抗體Ⅰ稀釋液	12ml×1瓶
4	酶標試劑	12 ml×1瓶
5	濃縮洗滌液	50 ml×1瓶
6	顯色液A液	8 ml×1瓶
7	顯色液B液	8 ml×1瓶
8	終止液	8 ml×1瓶
9	覆板貼膜	3張
10	說明書	1份
11	自封袋	1個

試劑盒B （-20℃保存）
  

1	苯甲基磺酰氟（PMSF）	0.9 ml×1瓶
2	Gal-BSA標準品	120μl×1瓶
3	抗體Ⅰ(特異性抗-Gal抗體)	0.6ml×1瓶

 


 
自備材料：
1.      Gal抗原陰/陽性參考品為國家標準品物質, 須自行到中國食品藥品檢定研究院購買。

1. 2ml或5ml離心管；
2. 移液器及吸頭。

 
樣本要求：
樣品采集后，盡早進行樣本制備并檢測，若不能及時進行檢測，須在-20℃保存并避免反復凍融。
 
安全性：

1. 避免接觸試劑盒中的顯色液A液、B液以及終止液，一旦接觸需立即用大量水沖洗；
2. 試驗過程中不要吸煙、飲食以及使用化妝品；
3. 不要用嘴吸試劑盒中的任何液體。

 
 
試劑盒的保存和使用注意事項:
1.       試劑盒分A和B兩盒，A盒各組分需要在2~8℃保存，B盒各組分需要在-20℃保存，使用前恢復到室溫并充分混合均勻；
2.       根據樣品的量決定所需要的板子條數，建議樣品做3個復孔，實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，并密封保存，防止受潮；
3.       未用完的試劑，應包裝好，避免不同批號混用，同時避免長期打開蓋子放置；
4.       試劑盒過保質期不要使用；
5.       顯色液B液對光敏感，避免長期暴露于陽光下，避免用手接觸，實驗完成后應在規定時間內讀取OD值；
6.       裂解液在使用前需要按照裂解液體積1%的量加入苯甲基磺酰氟（以下簡稱PMSF），現用現加，加入PMSF的裂解液要一次用完，不可存留再用；
7.       抗體Ⅰ需要使用抗體Ⅰ稀釋液進行20倍稀釋后使用；
8.       洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水；
9.       加入試劑的順序應一致，以保證所有孔反應時間一樣；
10.   按照說明書標示的時間以及順序進行操作。
 
樣品預處理:
1.  Gal抗原陰/陽性參考品制備：精確稱取一定量的陰性/陽性參考品，置于2ml或5ml無菌離心管內，加入裂解液（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），制成樣品濃度為2mg/ml混懸液，在室溫放置3h后，4000r/min、離心10min，取上清液備用。
2.  標準品制備：在陰性參考品樣品中加入裂解液（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），配制成2mg/ml作為陰性基質液，在其中加入Gal-BSA標準品，使其終濃度為 4µg/ml，之后依次用等量陰性基質液進行梯度稀釋，合計7個系列濃度。
3.  檢測樣品的制備：精確稱取試驗樣品（2 mg～10 mg）置于2ml或 5 ml無菌離心管內，若為固態塊狀或片狀試驗樣品，則用無菌眼科剪將樣品剪裁成細小碎塊。加入裂解液到一定濃度（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），濃度根據樣品大致含α-Gal抗原量決定，低溫勻漿2 min～10 min，至樣品全部粉碎，無肉眼可見明顯顆粒，形成均勻組織勻漿。室溫放置3 h至樣品全部裂解，4000r/min離心10min，取上清液備用。
 
樣品與抗體Ⅰ反應：
將制備好的樣品與抗體Ⅰ（使用抗體Ⅰ稀釋液將抗體Ⅰ進行20倍稀釋）等體積混合（標準品終濃度為2 µg/ml，1 µg/ml，0.5 µg/ml，0.25 µg/ml，0.125 µg/ml，0.0625 µg/ml，0.03125 µg/ml；檢測樣品的終濃度減半）后，在37℃輕微震蕩溫育2h，之后轉4℃過夜。使用前在14000×g，4℃，離心30min后，取上清使用。
 
試劑盒操作過程（剩余抗體I的檢測）:
1.  配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或純化水20倍稀釋。
2.  加樣：分別在相應孔中加入抗體Ⅰ反應后的樣品或標準品上清液各100 µl。
3.  溫育：用封板膜封板后，置37℃震蕩溫育60分鐘。
4.  洗板：小心揭掉封板膜，用排槍或其他移液器吸干樣品，在每孔中注入洗液200 µl，浸泡30 s，棄去板孔中洗液，洗滌5遍，最后一次盡量扣干。
5.  加酶：每孔加入酶標試劑100 µl。
6.  溫育：用封板膜封板后，置37℃震蕩溫育30分鐘。
7.  洗板：小心揭掉封板膜，用排槍或其他移液器吸干樣品，在每孔中注入洗液200 µl，浸泡30 s，棄去板孔中洗液，洗滌5遍，最后一次盡量扣干。
8.  顯色：將顯色液A液和顯色液B液等體積混合均勻，每孔加入混合好的顯色液100 µl，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色30分鐘。
9.  測定：取出酶標板，迅速在每孔加終止液50 µl，輕輕振蕩混勻后，立即測定結果。在450 nm波長處測定各孔的OD值。
 
檢測結果計算與分析:
1.  根據測定的吸光度值，計算各樣品的抗體I結合抑制率。
        IR = ｛(M-b)-(T-b)｝/(M-b)×100 %
式中:
IR --抗體I結合抑制率(Inhibition rate),%；
M  --抗體I/陰性基質液反應OD值均值（100 %反應）；
T  --試驗樣品反應(Test sample)OD值均值（剩余抗體I的反應）；
b  --裂解液反應(blank)OD值均值。
2.  以標準品樣品系列稀釋濃度為橫坐標（X），抗體I結合抑制率（小數）為縱坐標繪制最佳曲線方程，推薦使用對數方程，或者四參數方程軟件，獲得四參數方程，直接把待測樣品的抗體I結合抑制率代入方程式，計算待測樣品相當于標準曲線樣品（Gal-BSA標準品）的量，再乘以1.82×1014/µg(Gal-BSA)，計算單位質量待測樣品的Gal抗原含量。
 
試劑盒性能：
1.  靈敏度：最小的檢測濃度≥標準品的第5個倍比系列稀釋濃度。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為＞0.950。
2.  特異性：Gal抗原陰性生物材料參考品不會檢出Gal抗原，陰性參考品的檢測OD值與裂解液對照孔的反應OD值不存在顯著性差異。
3.  重復性：樣品檢測結果的變異系數（CV）≤30%。
4.  檢測回收率：標準曲線樣品的檢測回收率為80%～120%。
 
試劑盒局限性：
樣品前處理是影響最終檢測結果的重要因素，應保證抗原的充分暴露。樣品中基質的干擾不可避免，為非線性的。因此，需要盡可能保證標準曲線樣品的組成與待檢測樣品的組成相同或者相近。