干細胞培養方法
 

       當前干細胞最主要的培養方法仍是2D培養，2D培養僅在一個平面上支持干細胞生長，無法再現生物體內細胞真實的3D立體微環境。2D培養環境在生物活性、培養基結構、營養物質的釋放等很多方面均遠不及3D培養，使干細胞逐漸喪失其原有的性狀、形態、結構和功能，導致其研究結果與體內試驗結果經常不一致，精確性較低，所提供的培養環境與生物體內微環境差距甚大，必然對干細胞的增殖分化產生負面作用。同時，2D培養增殖效率低，已經無法滿足臨床干細胞大劑量應用的需求。正是由于2D培養局限性太多，促使國內外學者對3D培養技術和3D培養體系進行深入探索。
 

 

     （A）在2D培養中生長的從上面(頂部面板)觀察圖像，細胞表面保持正常形態; (B)在3D培養中生長的從上面(頂部面板)觀察圖像，細胞表面保持正常形態; (C)在2D培養中生長的從側面(底部面板)觀察圖像，細胞厚度嚴重收縮; (D)在3D培養中生長的從側面(底部面板)觀察圖像，細胞厚度仍保持正常體內形態。

       3D干細胞培養技術

       體外細胞培養的一個重要原則是需模擬體內細胞生長環境，該模擬系統中最重要的核心因素是細胞與培養環境之間的相互作用。不同于傳統的二維單層細胞培養，三維干細胞培養技術(three-dimensional cell culture，TDCC，簡稱3D培養)是指通過細胞聚集建立細胞球或將細胞嵌入支架上或支架內來模擬真實生物體組織的ECM（細胞外基質），進而在一定程度上模擬體內微環境。3D培養技術既能保留體內細胞微環境的物質及結構基礎，又能展現細胞培養的直觀性及條件可控性的優勢。

       那么，你知道目前都有哪些3D細胞培養技術嗎？一起來看一下吧！3D細胞培養技術很多，但總結起來主要可分為3類：

        1.3D水凝膠

       水凝膠是水膨脹性的高分子網絡，被設計用來模擬復雜的細胞外微環境。水凝膠由水、ECM蛋白和生長因子組成。用于三維細胞培養的第一代水凝膠是從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的ECM聚合物。

       舉例：ECM凝膠

       從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的天然ECM，可以提供非常豐富的營養，與細胞的發育具有高度兼容性。ECM的主要組分是層粘連蛋白、IV型膠原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。這種水凝膠聚合物可通過20-40°C熱激活，凝膠化過程也是可逆的(蛋白質濃度:8–12mg/ml)。

        ECM凝膠
 
       在BME中培養16天后，對MCF-10A細胞進行染色：A）細胞染色試劑盒（結構）；B）細胞核；C）線粒體膜電位； BME中培養12天后，對PC-3細胞進行染色：D）Calcein AM（細胞活力）；E）CPA染料1（細胞核）；F）線粒體膜電位

        2.細胞聚集

       基于細胞聚集的方法不需要額外添加細胞外基質蛋白，細胞會產生內源的細胞外基質蛋白并不斷聚集形成較大的聚集體。由此形成的球體大小和組分取決于起始細胞數量、孵育時間和細胞增殖率等因素。

       舉例：懸滴培養板

       3D懸滴培養平板的孔板經過特殊設計，當在小孔上方加入一滴細胞懸液時，孔板的幾何構造就會引導細胞和培養基通過一個小洞，進而形成一個穩定的懸滴。滴入口位于每個培養孔的上方，可用來更換培養基，添加外源胞外基質、生長因子、小分子，也可用來加入細胞形成混合培養物。

       3.培養支架

       基本原理：支架可提供一種物理支撐，細胞可以進入支架生長和行使功能。孔隙分布、暴露平面區域和孔隙度具有關鍵作用，其數量和分布會影響細胞滲透入支架的效率，而依據不同的制作工藝，支架具有不同的結構、隨機或定制的孔隙分布。

       上述三類技術可根據產品是否為細胞提供支撐材料，3D干細胞培養體系大體可分為有材料支撐培養和無材料支撐培養（通過細胞聚集形成細胞球體）兩種類型。由于球體結構存在難以控制以及與天然組織的差異等缺陷，因而限制了其作為3D培養模型的應用，而3D有材料體系因為能夠模擬活體組織復雜的三維立體結構而受到研究者青睞，成為當前3D干細胞主流培養體系。 

       3D干細胞培養材料

       3D干細胞培養材料中適宜的空隙結構、表面活性、機械強度及生物相容性，使干細胞能更好地在3D材料上黏附、增殖、分化，建立材料內部各組分與干細胞間的緊密聯系及動態相互作用，形成一定的3D結構。

      目前，常用的培養材料有天然材料（如膠原、透明質酸、纖維蛋白、殼聚糖）、合成材料（如聚乳酸、聚己酸內酯、聚乳酸-羥基乙酸、聚乙烯對苯二甲酸酯）以及新型復合材料（包括兩大類：天然材料相互復合、天然材料與合成材料復合，是如今3D干細胞培養研究的熱門）。

       材料的主要作用是為細胞提供原始支撐，同時也作為可溶性因子的擴散媒介，保證干細胞與材料更好黏附、遷移、增殖、分化以及細胞的長期生長。

       3D干細胞培養材料需要具備的特點：

       (1) 三維多孔結構  適宜的空間結構和孔隙率，有利于干細胞的黏附、生長增殖。

       (2) 較好的生物相容性  材料對干細胞無毒性作用，可以和干細胞穩定結合，且干細胞在生物體內不會誘發排斥或炎癥反應等。

       (3) 具備生物可降解性  有些材料可在生物體內自行降解，降解速率應保持在一個適宜范圍內，過慢會蓄積體內影響組織生長，過快則無法起到支持干細胞生長的效應。

       (4) 良好的表面活性  有利于干細胞與材料結合，可附帶更多的生長因子，對其表達和釋放也具有較好的促進作用。

       (5) 良好的成型能力和合適的力學強度  良好的力學強度是其能夠維持細胞生長空間的先決條件。

       符合上述所有條件的全新一代的3D FloTrix™ 干細胞微載體應運而生了：
 

 
       3D FloTrix™ 干細胞微載體

       3D FloTrix™ 干細胞微載體為全球專利產品，由數萬顆彈性三維多孔微載體組成， 孔隙率>90%，粒徑大小可控于50-500μm區間， 均一度≤100μm，且生化、物理性質可定制，形成真正的3D仿生培養。

       我們來看看實物吧：
 

       3D FloTrix™ 干細胞微載體：

       優勢：
 

 

       3D FloTrix™ 干細胞微載體與市面上其他常見微載體比較：
 

 
       3D FloTrix™ 干細胞微載體特點及優勢總結：

        1.一步法快速接種
        2. 原位傳代，免消化
        3.連續擴增，避免污染
        4.原位凍存微組織，保持活性及三維結構
        5.已獲得一級醫療器械資質（目前唯一獲批醫療器械資質的載體）
        6.藥用級別原料：藥典有收錄，確保使用安全性（目前市面上唯一藥用級別原料載體）
        7. 彈性微孔結構 ：耐受剪切力，保護細胞不受損傷
        8.有效表面積大 ：9000cm2/克，約可承載108-109細胞
        9.無菌片劑包裝：便于定量，無需滅菌溶脹，遇水即散
       10.可調控可定制：可為不同細胞定制適合微環境

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       華龕生物公司現擁有600平米的研發中心，2000平米的GMP生產平臺。核心成員均由清華校友組成。3D FloTrix系列產品可提供全球領先的可實現針對干細胞大規模培養擴增工藝的整體解決方案，同時也是全球原創的針對干細胞的注射型創新藥劑產品。

       相關技術產品已在國際知名的Nature Materials，PNAS, Nature Communication, Biomaterials等期刊雜志刊登，并被國內外媒體廣泛報道。已獲得2016，2017年國家重點研發計劃專項的支持與應用。公司產品目前已實現產業化及市場銷售，核心產品正處于臨床注冊申報階段，目前公司已完成數千萬元融資。

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