老年神經退行性疾病，如阿爾茨海默癥(AD)、肌萎縮性側索硬化癥、Ⅱ型糖尿病等，目前困擾著全世界大約5億人，且這個數字仍在不斷迅速增長。尤其是阿爾茲海默癥（占70%以上），目前仍未有行之有效的診斷方法，因此無法得到有效的治療或預防。盡管當代病理學研究已經證實這種病理變化與具有神經毒性的β淀粉樣蛋白質的聚集有關，但其在神經元或腦組織中的聚集機制目前尚不清楚。現有的方法, 如電子顯微鏡、免疫電子顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、超分辨顯微鏡，通常都需要對樣品進行化學加工（標記染色等）,可能會對淀粉樣蛋白結構本身造成影響。而非標記方法，如表面增強拉曼光譜（SERS）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）, 前者受限于亞細胞水平上的低信噪比、自發熒光及不可逆的光損傷，后者其空間分辨率受限于紅外光波長（≈5–10 μm），且光譜可解譯性和準確性受到彈性細胞光散射所產生的米氏散射效應(Mie scattering effects)的嚴重影響，使得直接在亞微米尺度上研究淀粉樣蛋白質在神經元內的聚集行為十分困難。
 

      美國Photothermal Spectroscopy（PSC）公司開發的全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage， 是基于的光學光熱誘導共振（O-PTIR）技術，它克服了傳統FTIR技術的衍射極限和米氏散射效應，紅外光譜空間分辨率高達500 nm，且無需對樣品進行標記, 不再需要衰減全反射（ATR）技術進行厚樣品測試，且能夠無接觸和無損探測樣品，全程對樣品無污染，可以幫助科研人員更全面地了解亞微米尺度下樣品表面微小區域的化學信息，使得在亞細胞水平揭示生物分子結構成為了可能。美國Photothermal Spectroscopy（PSC）公司開發的全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage（如圖1A所示），使用可見探測束（532 nm）來測量樣品在脈沖紅外光束照射下的紅外光熱響應，具體體現為樣品反射率的變化，由于使用了可見光作為檢測光，使得其空間分辨率不再依賴于入射紅外光的波長，且單一特定探測光束的使用還可以消除米氏散射效應。           
                    

圖1. (A) 美國PSC公司非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage實物圖；（B）亞微米紅外成像示意圖：神經元樹突的AFM形貌圖,其中神經元直接在CaF₂基底下生長。mIRage采用兩束共線性光束: 532 nm可見(綠色)提取光束和脈沖紅外(紅色)探測光束，樣品的光熱響應被檢測為樣品由于對脈沖紅外光束的吸收而引發的綠色光部分強度的損失，使紅外檢測的空間分辨率提高到≈500 nm. (C) 小鼠大腦皮層初級神經元, 在CamKII促進下表達為tdTomato熒光蛋白，使得神經元結構填滿紅色，圖片標尺為20 μm。(D) 圖C區域放大圖片，箭頭指示樹突上的神經元刺。

      因為上述的巨大技術優勢和突破，非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage在生物學領域技術有廣泛的應用前景和潛力，可應用于諸如細胞學研究（蛋白質、磷脂結構分析，紅細胞、巨噬細胞成像等），臨床致病菌/病原微生物鑒定，癌癥診斷（細胞/組織），牙科/骨病變/眼科檢測，生物大分子損傷，生物組織識別，以及生物藥物檢測，法醫學等。

      近日，瑞典隆德大學的Klementieva教授團隊與美國PSC公司的Mustafa Kansiz博士合作，使用全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統在亞微米尺度上研究了淀粉樣蛋白沿著神經突直到樹突棘的聚集行為（圖1B和C），這是以往的實驗技術手段所不可能實現的。在該研究中，他們使用了大腦皮層初級神經元，這是因為它們易發生AD病變，且具有獨特的結構。初級神經元的這種形態特征使得可以在單個神經元層面上來測試全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統的分辨率和準確性。首先，他們在反射模式下獲得了高質量的紅外光譜，且不受米氏散射或基線失真等人為因素的干擾(圖2A,B)。值得注意的是，全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統其約為400 nm的橫向分辨率，使得他們能夠通過比較1740 cm^-1處的峰強度來檢測脂質含量的差異，以及通過對比酰胺II (1540 cm⁻¹)與酰胺I特征峰強度(1654 cm⁻¹)的比值來比較氨基酸(蛋白質)的種類和數量上的差異(圖2C,D)。這是科學家們首次獲取單個樹突棘的高分辨率的化學圖像和紅外光譜，以往其它測試方法是無法做到的。 

圖2. 使用非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage觀察初級神經元結構。 (A) 在1650 cm^-1處獲得的神經元的紅外圖像，顯示了蛋白質的分布; (B)中對應原始紅外光譜的位置用數字和圓點表示，圖片標尺為20 μm；（C）在1650 cm^-1處獲得的樹突的紅外圖像，數字表示D圖中獲得光譜的位置，圖片中標尺為20 μm；（D）在C圖中兩點處取的歸一化紅外光譜,體現了該方法的亞微米空間分辨率。紅色箭頭表示蛋白質結構的化學變化。

      為了在亞細胞層面上定位神經元中β片層結構，作者對APP-KO神經元進行了為時半小時的合成Aβ(1-42)處理（2×10−6 M），并使用非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage進行了化學結構的成像分析（圖3A）。對Aβ處理后的APP-KO神經元的紅外光譜進行分析證實，β片層結構可以在亞細胞水平上進行分辨。有趣的是,純Aβ(1-42)纖維在1625 cm⁻¹位置處有特征的紅外峰，當加入到神經元結構中后，β片層結構的特征峰移動到1630 cm^-1處，表明淀粉樣原纖維結構發生了變化，可能是由于其與細胞蛋白和/或細胞膜發生相互作用導致的（圖3B, C）。基于該發現，我們可以得出，在神經元中的淀粉樣蛋白的構型變化可能會引發阿爾茨海默癥進程中的不同機制。為進一步了解其形成機制，更多的方法學研究變得更加必要，如將非接觸式亞微米分辨紅外與免疫熒光顯微鏡結合起來，這種多模態成像模式可以在不同的細胞層面上更詳細分析特征蛋白的結構變化，如前突觸或后突觸，囊泡(溶酶體或內溶酶體)或其他細胞器。

圖3. 使用非接觸式亞微米分辨紅外測量系統Mirage觀察β片結構在處理后的初級神經元中的聚集行為。（A，B）APP-KO初級神經元在1650和1630 cm^-1處的明場和光熱紅外成像，彩色標度表示光熱振幅的強度，從最小值(藍色)到最大值(紅色)，閾值為50%(以0為中心)，插圖為放大或疊加后的紅外成像圖，圖片標尺為20 μm；（C）神經元中淀粉樣蛋白結構在2×10−6 M Aβ(1-42) (紅色)處理或不處理(綠色)后分別對應的紅外光譜。β片結構對應的特征紅外峰用紅色箭頭表示，光譜數據點間距為2 cm⁻¹，數據進行50次均一化處理。

      綜上所述，借助全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage，科學家成功首次揭示了初級神經元的分子結構，無需標記，且因為該技術是在非接觸模式下工作，不會對神經元造成損傷，這在研究脆弱或粘性的物質時顯得尤為重要。另外，該技術還能獲得亞微米尺度的紅外光譜，且不含由于背景失真或米氏散射造成的散射偽影。最新的技術進步表明，全新的非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage現在可以用來做活細胞成像,并保持相同的亞微米空間分辨率。在這種情況下，全新的非接觸式亞微米分辨紅外測量系統有望在β片層結構在活神經元的突觸附近的化學成像中發揮關鍵作用，并提供一個新的機會來研究神經毒性淀粉樣蛋白如何從一個患病的神經元傳播到一個健康的神經元，揭示阿爾茨海默癥的形成和發展機制。該工作發表在2020年的Advanced Sciences上（DOI: 10.1002/advs.201903004）。