創傷性腦損傷（TBI）是全球性的公共衛生問題。由于缺乏良好的診斷工具和干預手段，TBI患者數量被嚴重低估，尤其是在體育運動員和軍人群體中。目前TBI的診斷方式只有昂貴的神經影像技術和腦脊液（CSF）檢測。輕度創傷性腦損傷（mTBI）更是難以診斷，目前還沒有一種可以基于血液診斷的生物標志物。因此迫切需要血液中生物標志物的開發，以便在更早和更可治療的時間點確定大腦的癥狀和神經病理學變化。
 

美國加利福尼亞大學科研人員的早期工作證明了血漿神經源性外泌體（NDE）作為生物標志物可用于阿爾茲海默癥（AD）和其他疾病的神經退化檢測，然而其作為輕度創傷性腦損傷（mTBI）的診斷標志物的研究還很有限。所以該課題組選取了NDE和星形細胞源性外泌體（ADE）蛋白作為潛在的生物標志物來進行研究。本研究發現mTBI患者的NDE蛋白對體外培養的神經元樣受體細胞具有毒性，而ADE蛋白則沒有。mTBI患者的NDEs中存在神經退行性變的標志物，并提示這些NDEs可作為鑒別TBI發病機制的工具。這一研究成果于2019年10月發表于Frontiers in Neuroscience（IF=3.6）上。
 

 

研究對象

所有研究對象均為男性現役軍人，平均年齡21.87歲（SD=2.76），詳見表一。
 

 

研究結果

1.人血漿中的NDEs和ADEs蛋白的富集和分選

首先，研究人員使用結合有外泌體抗體和FITC復合物的磁珠來免疫富集人血漿中的NDEs和ADEs（圖1A）。使用CD171（神經細胞粘附分子配體1）來特異性免疫捕獲NDEs；GLAST（谷氨酸/天冬氨酸轉運體）用來免疫捕獲ADEs。富集后的復合物使用流式細胞儀根據綠色熒光強度進行分類。陽性對照為磁珠-抗體-外泌體-FITC復合物，陰性對照則為不含外泌體的磁珠-抗體-FITC復合物（圖1B）。由流式結果可知，實驗組和對照組在FITC+的數量上沒有明顯差異（圖1C）。針對外泌體標志物CD81的ELISA實驗也顯示，實驗組和對照組之間沒有明顯差異（圖1D）。
 

圖1

2.與對照組相比，mTBI患者血漿的NDEs和ADEs中Aβ42濃度水平較高，而NRGN的濃度水平較低

ELISA結果顯示，與對照組血漿樣本相比，mTBI組血漿樣本中Aβ42的水平在NDEs和ADEs中都顯著升高（圖2A），NRGN水平（圖2B）則顯著降低。兩組的P-T181-tau水平在NDEs和ADEs中均無顯著差異（圖2C）。兩組的P-S396-tau水平在NDEs中無顯著差異；而在ADEs中，與對照組相比，mTBI組P-S396-tau的水平升高，但無顯著性差異（圖2D）。在兩種來源的外泌體中，與NDEs相比，ADEs的Aβ42（ADE組：1.18 pg/mL；NDE組：0.29 pg/mL）和P-396-tau（ADE組：16.26 pg/mL；NDE組：5.47pg/mL）水平更高，但具體機制還不清楚。

圖2

用超靈敏單分子免疫陣列分析平臺（Simoa平臺）對血漿外泌體的蛋白定量顯示，在NDE組中，mTBI與對照的Aβ40（圖3A）、NFL（圖3B）和T-tau（圖3C）的濃度水平沒有顯著差異，而在ADE組中，mTBI與對照的Aβ40、T-tau和NFL的濃度水平在Simoa平臺上非常低，接近檢測不到。

 

圖3

本研究首次報道了在血漿NDE和ADE蛋白中，Aβ42和NRGN的濃度水平可以區分mTBI患者（見ROC分析，表3）。

3.實驗組的血漿NDE外泌體蛋白在體外對受者細胞具有毒性

研究人員還在體外測試了血漿NDE和ADE蛋白在神經元樣細胞中的致病潛能。已有研究表明，NDEs可以在體內傳播毒性蛋白，并在體外對受體細胞產生毒性。該研究首先用NDE或ADE蛋白處理PC12細胞（PC12細胞中已預先加入NGF，即神經生長因子進行誘導分化），再通過測定乳酸脫氫酶（LDH）在細胞培養基中的釋放量來評價外泌體誘導的細胞毒性。結果顯示經mTBI患者血漿NDEs處理過的細胞顯示出明顯的細胞毒性跡象，顯微照片清楚展示了樹突氣泡、抑制神經突起生長和細胞死亡等跡象（圖4A）。與對照組（100%存活率）相比，被mTBI患者的NDE蛋白處理過的細胞，經外泌體誘導后細胞毒性增加約三倍（286.7%）（圖4B，P<0.05）。同樣的，將不同分化的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞用NDE或ADE蛋白處理，同時用已確診的AD患者的血漿NDE蛋白作為陽性對照。可觀察到經由外泌體誘導的細胞毒性增加了大約三倍（265.8%），（圖4C，P＜0.05）。有趣的是，ADEs并沒有誘導細胞毒性或損害神經生長因子誘導的PC12細胞或SH-SY5Y細胞（圖4C）的膜完整性。
 

圖4
 

本研究發現血漿NDEs對受體細胞具有毒性，并首次報道血漿ADEs對神經元樣細胞無毒。血漿NDEs和AEDs中都含有可檢測的Aβ42和P-tau蛋白，但只有mTBI患者血漿中的NDE蛋白對體外培養的神經元樣細胞有毒性。一種解釋是神經元樣細胞不容易接受ADEs。另外一種解釋是，與血漿NDE組相比，血漿ADE組中Aβ42和P-tau濃度的降低不足以誘導產生細胞毒性。
 

小結

本文在血漿外泌體中蛋白質含量的變化，而先前的研究報道則在血清和/或腦脊液中進行。已知外泌體在細胞間穿梭并運輸蛋白質和miRNA等物質，有助于清除多余或受損的細胞內蛋白質及其細胞內溶物。然而目前在中樞神經系統中，外泌體轉運和功能背后的基本機制仍然未知，為了提高外泌體在治療和診斷中的臨床應用價值，我們必須更深入地了解這些細胞過程。
 

將外泌體轉運的蛋白作為潛在的生物標志物，在未來可能會產生重要的臨床應用。目前正在進行確定這些蛋白質在腦損傷后時間進程的研究，并需要闡明這些蛋白質是否可預測長期慢性和/或其他疾病。此外，本研究的研究對象是一個男性軍人群體，在正常人和女性mTBI群體中的適用性還需進一步探索和研究。
 

在過去的2019年，也是外泌體研究熱度持續升溫的一年，無論是其功能研究還是如何將其用于微創診斷的開發都有重大的研究進展。蛋白作為最終表達產物，外泌體蛋白研究領域也必將成為外泌體研究不可或缺的部分，Simoa是目前最靈敏的蛋白質檢測技術，飛克級別的檢測靈敏度可以彌補傳統Western Blot，ELISA等方法的不足，將極大推動外泌體中蛋白成分的研究。SBC目前具有成熟和完備的外泌體分離，鑒定以及Simoa蛋白質檢測平臺，歡迎實驗咨詢。

原文鏈接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnins.2019.01005/full