近年來，隨著生物藥市場和基因工程技術的發展，重組治療性抗體或者單抗的需求在生物藥中的比例也逐年上升。重組mAbs被應用于包括癌癥及免疫系統缺陷在內的許多疾病的治療當中。

重組mAbs通過基因工程技術改造后可以在多種宿主細胞表達。重組mAbs在表達后進行翻譯后修飾、蛋白質折疊、組裝及適當的糖基化才能具有生物學活性。由于各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類也不相同，不同宿主產生的mAbs，其生物活性和免疫原性也都各不相同。

大腸桿菌(E.coli)表達系統

在各種表達系統中，最早被采用進行研究的是大腸桿菌(E.coli)表達系統，其顯著的優點是易于操作，產量高，成本低，但是由于用E.coli生產的蛋白在蛋白質翻譯后缺乏加工機制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，在人體內易被降解，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。此外，E.coli還易產生內毒素超標和包涵體等問題。

哺乳動物細胞表達系統

目前所有哺乳動物細胞表達系統中，中國倉鼠卵巢（CHO）細胞應用最為廣泛，由于其酷似人類的翻譯后修飾和內在的蛋白質折疊機制的優點，是重組mAbs生產的首選平臺，占據了70%的重組mAbs生產制備，并且大部分為單克隆抗體。為了在早期治療性研究中得到毫克到克級的蛋白質，蛋白瞬時表達系統被廣泛應用，目標蛋白均可以在5-8周內提供。這種快速的蛋白制備技術與穩定細胞株構架相比，大大縮短了研發周期，從而促進了生物治療藥物的研發進程。

根據目的蛋白表達的時空差異，可將哺乳動物細胞表達系統分為瞬時和穩定表達系統。

1、瞬時表達系統是指以外源基因導入宿主細胞(轉染)為基礎，在有限的時間內表達的技術。轉染后，質粒DNA分子留在細胞內，不整合到基因組中，最終隨著時間的推移和細胞分裂而丟失。在抗體上清收獲之前，抗體上清的制備生產通常限于轉染后7-14天，時間比較短暫。瞬時表達系統的優勢是操作過程簡捷，實驗周期短。另一個顯著的優勢是瞬時表達的靈活性。只有改變質粒DNA中包含的目的基因，就可以表達幾種蛋白質，靈活性比較高。這些優勢讓瞬時表達系統在抗體藥物早期的高通量篩選流程中承擔了很重要的角色。當目的蛋白或者抗體由于毒性問題而不能讓細胞持續表達時，瞬時表達也是一種合適的選擇^[1,2]。此外，瞬時表達可以從非常小的規模（96孔板）^[3]擴大到大容量培養容器中（生物反應器中的數百升）^[4]。

圖1.瞬時轉染元件^[5]

2、穩定表達系統是指載體進入宿主細胞，經過選擇加壓篩選培養，載體DNA穩定整合在細胞內，目的蛋白的表達持久、穩定。由于需要抗性篩選、加壓擴增等步驟，穩定表達相對實驗周期長，耗時耗力。

圖2.穩轉細胞系構建流程^[6]

生物醫藥界“糖寶”-CHO

1957年美國科羅拉多大學的Puck教授從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得一種上皮貼壁型細胞，并建立了首批CHO細胞系，為命名為CHO-K1細胞系，是目前在生物領域中廣泛使用的細胞系^[7]。，此后建立了許多不同的細胞系，如CHO-S、CHOK1SV、DG44等^[8]。

圖3.CHO細胞發展^[9]

1、CHO細胞的應用優勢

1. 具有清晰地歷史背景和監管機構的認可，安全性高；

2. 具有準確的轉錄后修飾功能，表達的蛋白在分子結構、理化性質和生物學功能等方面最接近于天然蛋白分子；

3. 既可以貼壁生長，又可以懸浮培養，并且具有較高的耐受剪切力和滲透壓的能力；

4. 具有重組基因的高效擴增和表達能力，外源蛋白整合穩定；

5. 具有產物胞外分泌的功能，并且很少幾乎不分泌自身的內源蛋白，便于下游產物的分離與純化；

6. 能以懸浮培養方式或者在無血清培養基中達到高密度培養，可以大規模生產。

2、改善CHO細胞的表達水平

近年來，研究人員和細胞開發公司已經開發了許多策略來改善CHO細胞表達水平。表達EBNA1蛋白或T抗原的CHO細胞系，其制備抗體的能力會得到增強。還有其它CHO細胞系基因工程策略，例如過表達未折疊蛋白應答因子或敲除促凋亡基因，也可以顯著地增加CHO細胞的表達能力。表達工藝的優化，如化學添加，溫度偏移，或更長的培養時間等方法，均可以增加其表達水平。

針對于轉染效率、生產力和生長特性，很多產品公司對CHO細胞進行改造及優化，目前被應用CHO-S細胞系，商品名為ExpiCHO-S^TM。ExpiCHO-S細胞經懸浮培養后，呈最小的聚集趨勢，在表達培養基中呈高密度生長，能顯著提升瞬時表達的產量和效率。穩定的細胞系表達能力，穩定的產品質量和較高的產率，CHO細胞表達系統已成為生物制藥工業中制備大量蛋白質的首選方法。相信在不久的將來，有更多高質量的重組mAb通過CHO細胞制備出來。

好啦好啦，今天的基礎小知識分享到此結束，祝大家周末愉快，咱們后會有期啦~~

參考資料：

[1] Nallet S, Amacker M, Westerfeld N, et al. Respiratory syncytial virus subunit vaccine based on a recombinant fusion protein expressed transiently in mammalian cells. Vaccine. 2009;27:6415–6419.

[2] Mignaqui AC, Ruiz V, Perret S, et al. Transient gene expression in serum-free suspension-growing mammalian cells for the production of foot-and-mouth disease virus empty capsids. PLoS One. 2013;8:1–9.

[3] Raymond C, Tom R, Perret S, et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for largescale and high-throughput applications. Methods. 2011;55:44–51.

[4] Tuvesson O, Uhe C, Rozkov A, et al. Development of a generic transient transfection process at 100 L scale. Cytotechnology. 2008;56:123–136.

[5] Gutiérrez-Granados S, Cervera L, Kamen AA, et al. Advancements in mammalian cell transient gene expression (TGE) technology for accelerated production of biologics. Crit Rev Biotechnol. 2018 Sep;38(6):918-940.

[6] Lai T1, Yang Y, Ng SK. Advances in Mammalian Cell Line Development Technologies for Recombinant Protein Production. Pharmaceuticals (Basel). 2013 Apr 26;6(5):579-603. 

[7] PUCK TT. The genetics of somatic mammalian cells. Adv Biol Med Phys. 1957;5:75-101.

[8] Stolfa G1, Smonskey MT, Boniface R. CHO-Omics Review: The Impact of Current and Emerging Technologies on Chinese Hamster Ovary Based Bioproduction. Biotechnol J. 2018 Mar;13(3):e1700227. 

[9] Lewis NE, Liu X, Li Y, et al. Genomic landscapes of Chinese hamster ovary cell lines as revealed by the Cricetulus griseus draft genome. Nat Biotechnol. 2013 Aug;31(8):759-65. 
 

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