IVIS視角——IVIS系統在植物領域的應用（一）
在往期分享中，我們介紹了IVIS成像系統在動物水平的眾多應用，其實IVIS同樣可以用于全植物成像。此次我們就分享IVIS在水稻氮代謝研究中的應用。
氮是植物生長發育所必需的養分，但其在土壤中的濃度往往達不到最佳作物生長濃度。因此，提高作物氮素利用率被認為是農業生物技術的一個主要目標。然而，關于作物氮代謝仍有許多需要了解的地方。
在此，研究人員開發了一個分子傳感器系統來監測水稻中氮的狀態，該方法發表在《Frontiers in Plant Science》雜志上。研究中首先利用該系統研究了尿囊素的作用，尿囊素分解為尿囊素衍生的代謝物，在低濃度下作為氮源使用。參與尿素代謝的兩個基因尿囊素酶(OsALN)和尿素滲透酶1 (OsUPS1)，對氮狀態高度敏感，在低氮條件下，OsALN迅速上調，而高氮條件下OsUPS1表達上調。基于上述機制，研究人員培育了含有氮分子傳感器系統的[proALN::ALN-LUC2]和[proUPS1::UPS1-LUC2]轉基因水稻。這種轉基因的表達可以模擬內源性的轉錄調控，即OsALN和OsUPS1基因對外源N狀態的響應。
文中使用兩種方法來測定分子氮傳感器的能力：
方法一：在長期培養中，轉基因水稻植株在高濃度氮源培養基(GM+N)或不含氮源的生長培養基(GM-N)中培養5天，隨后使用IVIS活體成像系統進行成像及定量。
結果顯示，生長在GM+N培養基中的 proUPS1::UPS1-LUC2 水稻植株表現出更高的熒光素酶活性（圖1A）。為了對發光信號進行定量，研究人員測定了5個獨立的純合系（具有單個基因拷貝）。生長在GM+N培養基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株發光信號強于GM-N組20倍，而強于對照組約2,800倍（圖1B）。
方法二：在短期培養實驗中，轉基因水稻植株先在GM-N培養基中培養4天，第5天在加入100nM硫酸銨。結果顯示，同長期實驗結果一樣，生長在后期加 氮培養基中proUPS1::UPS1-LUC2 植株，發光信號更強（圖1C）。同樣對5株獨立的純合系進行了定量，生長在后期加N培養基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株生物發光信號強于GM-N培養基中約50倍，而強于對照組13,000倍（下圖1D）。
圖1.在高氮培養條件下，proUPS1::UPS1-LUC2 具有很強的發光信號。
(A)對照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM+N或者GM–N培養基 中培養5天；
(B)5個獨立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(A)條件下，發光定量結果；
(C)對照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM–N生長5天, 或者在GM–N培養基中生長4天，然后加入100 mM硝酸銨培養1天；
(D)5個獨立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(C)條件下的定量結果，以對照組作為基準進行標準化 。
這些結果說明，proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器能夠通過發光信號水平檢測外源氮的情況。
同樣在研究中對proALN::ALN-LUC2 植株進行了相同的處理。結果顯示，在長時間的培養實驗中，GM+N和GM-N培養基生長的proALN::ALN-LUC2 沒有明顯差異（圖2A）。對5株獨立的純品系進行發光信號定量，相比GM+N培養基，GM-N培養基生長的proALN::ALN-LUC2 植株發光信號要高約1.8倍，比對照組高約17倍（圖2B）。因此很難鑒定GM+N和GM-N培養基對生長的影響。而在短時間培養實驗中，連續生長在GM-N培養基中的proALN::ALN-LUC2，發光信號要強于加高氮培養1天的。
圖2.在低氮培養條件下，proALN::ALN-LUC2 植株顯示強的生物發光信號。
(A)對照組和proALN::ALN-LUC2 植株，在GM+N or GM–N培養基中培養.；
(B)A組相對定量結果；
(C)對照和proALN::ALN-LUC2 植株在 GM–N中培養5天，或者在GM–N培養基中培養4天，然后加入100 mM 硝酸銨再培養1天 ；
(D)C組相對定量結果；GM–N培養基生長的對照組植株作為基準進行標準化。
此外，在文章中，還利用IVIS活體成像系統，探討了該傳感器對于氮源是否具有選擇性及對于氮源的敏感性。結果顯示proUPS1::UPS1-LUC2 和proALN::ALN-LUC2 對于氮源無特異性，可以廣泛的作為水稻等植株中分子氮的傳感器。并且proUPS1: UPS1-LUC2 植株在硝酸銨、硫酸銨或硝酸鉀濃度> 1mM即表現出強烈的生物發光信號，而低氮濃度(< 0.01mM)信號減弱。0.1mM硝酸鉀proUPS1:: UPS1-LUC2 植株誘導強烈的生物發光信號，而0.1mM硝酸銨和硫酸銨則沒有。這表明， proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器監測高氮狀態，低氮狀態。proALN::ALNLUC2 在低氮濃度(<0.1 mM)下表現出較強的熒光素酶活性，而在高氮濃度下表現出較弱的活性(> 10mM)。
綜上，分子氮傳感器的信號反映了分子氮的內部狀態。結合IVIS活體成像技術，proALN::ALN-LUC2和proUPS1::UPS1-LUC2 可作為分子傳感器在不同研究中監測大米內部氮狀態。
文獻來源：Dong-Keun Lee, Mark C. F. R. Redillas, Harin Jung, Seowon Choi, Youn Shic Kim and Ju-Kon Kim. A Nitrogen Molecular Sensing System, Comprised of the ALLANTOINASE and UREIDE PERMEASE 1 Genes, Can Be Used to Monitor N Status in Rice. Front. Plant Sci, 18 April 2018.
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