菌種選育的步驟及需要注意的問題
瀏覽次數:249 發布日期:2019-8-7
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菌種選育Loremreferentibus(英語:Strain selection 日語:ひずみの選択 法語:la sélection des souches 俄語:Штаммвыбор 德語:Stammselektion )微生物菌種是決定發酵產品的工業價值以及發酵工程成敗的關鍵,只有具備良好的菌種基礎,才能通過改進發酵工藝和設備以獲得理想的發酵產品。菌種用途廣泛涉及食品、醫藥、工農業、環保等諸多領域。
一、菌種選育的步驟
自然選育的步驟主要是:采樣,增長培養,培養分離和篩選等。
⒈采樣 篩選的菌種采集的對象以土壤為主,也可以是植物、腐敗物品和某些水域等。土壤是微生物的匯集地,從土壤中幾乎可以分離到任何所需的微生物,故土壤往往是首選的采集目標。微生物的營養需求和代謝類型與生長環境有很大關系。
⒉富集培養 由于采集樣品中各種微生物數量有很大差異,若估計到要分離的菌種數量不多時,就要人為增加分離的概率,增加該菌種的數量,稱為富集培養。
⒊純種培養 盡管通過增長培養的效果很好,但是得到的微生物還是處于混雜狀態,因為樣品中本身含有許多種類的微生物。所以,為了取得所需的微生物純種,增殖培養后必須進行分離。
平板分離法由接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料,在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線,微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少,并逐步分散開來。如果劃線適宜的話,微生物能一一分散,經培養后,可在平板表面得到單菌落。
分離方法有三種:即劃線分離法、稀釋法和組織分離法。
稀釋分離法 在溶液中再加入溶劑使溶液的濃度變小。亦指加溶劑于溶液中以減小溶液濃度的過程。濃溶液的質量×濃溶液的質量分數=稀溶液的質量×稀溶液的質量分數生產能力考察 初篩一般通過平板稀釋法獲得單個菌落,然后對各個菌落進行有關性狀的初步測定,從中選出具有優良性狀的菌落。例如,對抗生素產生菌來說,選出抑菌圈大的菌落;對于蛋白酶產生菌來說,選出透明圈大的菌落。此法快速、簡便,結果直觀性強。缺點是培養皿的培養條件與三角瓶、發酵罐的培養條件相差大,兩者結果常不一致。
二、菌種選育需要注意的問題
誘變育種應注意的問題
(1)挑選優良的出發菌株 出發菌株就是用于育種的原始菌株。出發菌株適合,育種工作效率就高。參考以下實際經驗選用出發菌株:①以單倍體純種為出發菌株,可排除異核體和異質體的影響;②采用具有優良性狀的菌株,如生長速度快、營養要求低以及產孢子早而多的菌株;③選擇對誘變劑敏感的菌株。由于有些菌株在發生某一變異后,會提高對其它誘變因素的敏感性,故可考慮選擇已發生其他變異的菌株為出發菌株。④許多高產突變往往要經過逐步累積的過程,才變得明顯,所以有必要多挑選一些已經過誘變的菌株為出發菌株,進行多步育種,確保高產菌株的獲得。
(2)菌懸液的制備 一般采用生理狀態一致(用選擇法或誘導法使微生物同步生長)的單細胞或孢子進行誘變處理。所處理的細胞必須是均勻而分散的單細胞懸液。分散狀態的細胞可以均勻地接觸誘變劑,又可避免長出不純菌落。由于某些微生物細胞是多核的,即使處理其單細胞,也會出現不純的菌落。有時,雖然處理的是單核的細胞或孢子,但由于誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈,故某一突變無法反映在當代的表型上,而是要經過DNA的復制和細胞分裂后才表現出來,于是出現了不純菌落,這就叫表型延遲。上述兩類不純菌落的存在,也是誘變育種工作中初分離的菌株經傳代后很快出現生產性狀“衰退”的主要原因。鑒于上述原因,因此用于誘變育種的細胞應盡量選用單核細胞,如霉菌或放線菌的孢子或細菌的芽孢。
細胞的生理狀態對誘變處理也會產生很大的影響。細菌在對數期誘變處理效果較好;霉菌或放線菌的分生孢子一般都處于休眠狀態,所以培養時間的長短對孢子影響不大,但稍加萌發后的孢子則可提高誘變效率。
(3)選擇簡便有效、最適劑量的誘變劑 誘變劑主要有兩大類,即物理誘變劑和化學誘變劑。物理誘變劑如紫外線、X射線、γ射線和快中子等;化學誘變劑種類極多,主要有烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物。最常用的烷化劑有N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基亞硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)和環氧乙烷等。目前常用的誘變劑主要有紫外線(UV)、硫酸二乙酯、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝基甲基脲(NMU)等。后兩種因有突出的誘變效果,所以被譽為“超誘變劑”。劑量的選擇受處理條件、菌種情況、誘變劑的種類等多種因素的影響。劑量一般指強度與作用時間的乘積。在育種實踐中,常采用殺菌率來作各種誘變劑的相對劑量。要確定一個合適的劑量,通常要進行多次試驗。在實際工作中,突變率往往隨劑量的增高而提高,但達到一定程度后,再提高劑量反而會使突變率下降。根據對紫外線、X射線和乙烯亞胺等誘變效應的研究結果,發現正變較多地出現在偏低的劑量中,而負變則較多地出現于偏高的劑量中,還發現經多次誘變而提高產量的菌株中,更容易出現負變。因此,在誘變育種工作中,目前比較傾向于采用較低的劑量。例如,過去在用紫外線作誘變劑時,常采用殺菌率為99%的劑量,而近年來則傾向于采用殺菌率為30%~75%的劑量。
(4)突變體的篩選 誘變處理使微生物群體中出現各種突變型,其中絕大多數是負變株。要獲得預定的效應表型主要靠科學的篩選方案和篩選方法,一般要經過初篩和復篩兩個階段的篩選。