研究背景：

電針鎮痛效應目前已經在世界范圍內得到了廣泛認可，但其在中樞神經系統的確切靶點和細胞特異性的鎮痛機制仍然沒有得到充分的認識。［1-3］。已有研究證實，電針可以誘導c-fos在中腦導水管周圍灰質（periaqueductal gray, PAG）中特異性表達［4］，腹外側中腦導水管周圍灰質(ventrolateral periaqueductal gray, vlPAG)是介導疼痛調節的神經通路的重要組成部分［5］。

內源性鎮痛物質阿片肽和大麻素通過間接抑制局部GABA能中間神經元的抑制效應來激活下行通路，因此使輸出神經元對脊髓的痛覺信息傳遞產生去抑制作用［6］。內源性大麻素系統是中樞神經系統中控制疼痛傳導和針刺鎮痛的重要神經調節系統，其介導的抗傷害作用在下行抑制性鎮痛通路的激活中起到重要作用［7-8］。 

vlPAG中的GABA能神經元和谷氨酸能神經元在傷害性信息處理中起著重要而又復雜的作用。在vlPAG中微量注射谷氨酸激動劑或GABA拮抗劑可以產生顯著的抗傷害性刺激效應［9,10］。大麻素受體1(Cannabinoid receptor 1, CB1)在PAG中GABA能神經元和谷氨酸能神經元的神經末梢均有表達，CB1受體的激活可能調節GABA能和谷氨酸能神經元的傳遞［11-12］。之前的研究結果表明，CB1受體參與電針鎮痛［13］。那么vlPAG中GABA能神經元和谷氨酸能神經元是否參與CB1受體介導的電針鎮痛呢？

2019年5月17日，華中科技大學同濟醫學院神經生物學系李熳團隊在《Frontiers in Neuroscience》上在線發表了題為“Inhibition of GABAergic Neurons and Excitation of Glutamatergic Neurons in the Ventrolateral Periaqueductal Gray Participate in Electroacupuncture Analgesia Mediated by Cannabinoid Receptor”的文章。該研究發現了電針通過CB1受體激活vIPAG中GABA能神經元和抑制谷氨酸能神經元而發揮鎮痛作用，vIPAG中GABA能神經元上的CB1受體是電針鎮痛的重要靶點。該研究為電針能夠通過CB1受體雙向調控vIPAG中的GABA能神經元和谷氨酸能神經元而產生鎮痛效應的機制提供了新的實驗證據。

電針能有效降低CCI和KOA小鼠的疼痛敏感性

首先，團隊對小鼠采用與大鼠坐骨神經慢性損傷（CCI）［14］類似的方法，使其產生神經病變來制備CCI模型；采用左膝關節內注射碘酸單鈉（MIA）來誘導膝骨關節炎（KOA）模型。通過電針治療CCI和KOA小鼠，發現電針顯著增加其機械痛閾值和熱痛閾值（圖1A-D）。并且在條件性位置偏愛實驗中，小鼠在與電針治療進行條件性配對后，逗留在明箱的時間顯著增加（圖1E-H）。

圖1.電針能有效降低CCI和KOA小鼠的疼痛敏感性

抑制vlPAG中GABA能神經元產生鎮痛效應

課題組為了驗證抑制vlPAG中的GABA能神經元是否可以發揮鎮痛作用，應用了化學遺傳學策略，將rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒和rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gi)-mCherry-WPRE-pA病毒混合物注射到CCI和KOA小鼠vlPAG的右側，目的是特異性的抑制GABA能神經元的活動 (圖 2A)。這種病毒混合物同樣注射到GAD67-GFP小鼠的右側vlPAG區，用來驗證病毒的轉染效率(圖2B, C)。vlPAG中約有80.5%標記上的神經元和GAD67-GFP陽性神經元共定位(圖 2D)。

圖2.病毒混合物標記率 

隨后，化學遺傳抑制CCI和KOA小鼠GABA能神經元，能有效地模擬電針的效應，包括鎮痛效應(圖3A–H).

圖3.VlPAG中GABA能神經元的化學遺傳抑制能模擬EA的效應

激活vlPAG中GABA能神經元只能部分減弱電針的鎮痛效應

接下來，為了驗證激活GABA能神經元是否能翻轉電針的鎮痛的效應。團隊將rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒和rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA病毒混合物注射到CCI和KOA小鼠vlPAG中以達到激活GABA能神經元的目的。

意外地發現，激活vlPAG中GABA能神經元后只能部分降低電針治療組小鼠的機械痛閾值和熱痛閾值(圖 4A-D)，同時也只能部分降低條件性位置偏愛實驗中小鼠待在明箱的時間（圖4E-H）。

圖4.vlPAG中GABA能神經元的化學激活僅部分減弱了EA的效應

激活vlPAG中GABA能神經元和抑制谷氨酸能神經元可以有效拮抗電針的鎮痛效應

單獨激活GABA能神經元只能部分的減弱電針的鎮痛效應，為了驗證GABA能神經元和谷氨酸能神經元都參與了電針的鎮痛效應。研究團隊在vlPAG中GABA能神經元被激活的基礎上，另外使用rAAV-CaMKIIa-HA-KORD-IRES-mCitrine-WPRE-pA病毒來選擇性抑制vlPAG中的谷氨酸能神經元的活動。發現激活vlPAG中的GABA能神經元并抑制vlPAG中的谷氨酸能神經元可以大幅降低小鼠的機械縮腿閾值和熱痛閾值(圖5A-D)，以及在條件性位置偏愛實驗中明箱逗留的時間(圖 5E-H)。

圖5.vlPAG中的GABA能神經元的化學激活與VlPAG中谷氨酸能神經元的化學抑制相結合能有效地減弱電針的效應

GABA能神經元上的CB1受體參與了電針對疼痛超敏反應的作用

接下來，為了驗證vlPAG中GABA能和谷氨酸能神經元的軸突上表達的CB1受體是否參與電針的鎮痛作用。研究人員在賽業生物構建的mCnr1flox/flox小鼠右側vlPAG中注射了rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒，特異性敲除vlPAG中GABA能神經元上的CB1受體；在mCnr1flox/flox小鼠右側vlPAG中注射rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA病毒，特異性敲除vlPAG中谷氨酸能神經元上的CB1受體(圖6A, C)。

圖6.特異性敲除位于vlPAG內的GABA能神經元上的CB1受體

實驗發現，特異性敲除GABA能神經元上的CB1受體可以消除電針的鎮痛效應，顯著降低了機械痛閾值和熱痛閾值(圖 7A-D)以及在條件性位置偏愛實驗中明箱的逗留時間（圖7E-H）。特異性敲除vlPAG中谷氨酸能神經元上的CB1受體僅輕微地減弱電針的鎮痛效應。結果表明，vlPAG中位于GABA能神經元上的CB1受體才是電針發揮鎮痛效應的基礎。

圖7.特異性敲除GABA能神經元CB1受體消除電針對疼痛反應敏感的效應

總而言之，該研究證明了vlPAG中GABA能神經元和谷氨酸能神經元在電針鎮痛效應中的新機制，即電針可以通過CB1受體同時抑制vlPAG中GABA能神經元和激活vlPAG中谷氨酸能神經元來發揮鎮痛效應。特異性敲除GABA能神經元上的CB1受體能夠完全消除電針的鎮痛效應，而只有激活vlPAG中的GABA能神經元聯合抑制vlPAG中的谷氨酸能神經元才能夠完全翻轉電針的鎮痛作用。電針能夠通過CB1受體在GABA能系統和谷氨酸能系統上同時發揮不同的調節功能。這項研究可能為臨床疼痛治療和鎮痛藥物的發展提供了一個新的思路。

作者簡介：

李熳，1973年出生，博士、教授、碩士研究生導師、博士研究生導師。湖北省神經科學學會副秘書長、武漢市針灸學會常務理事。evidence-based complementary and alternative medicine 雜志編委。

1995年6月畢業于湖北中醫學院，獲得針灸專業醫學學士學位；1998年6月畢業于湖北中醫學院，獲得針灸專業醫學碩士學位；2001年6月在原同濟醫科大學神經生物學系獲得中西醫結合基礎專業醫學博士學位，作為主要參加人員完成導師為關新民教授的國家自然科學基金課題 (no.39970889)，對電針治療炎性痛時“氣至病所” 的外周機制進行了一系列的研究，掌握了經絡實質和針刺鎮痛原理研究的前沿知識，并積累了豐富的技術經驗；2001年7月在華中科技大學同濟醫學院神經生物學系留校任講師； 2003年7月在華中科技大學同濟醫學院神經生物學系任副教授； 2006年3月－2007年9月在澳大利亞新南威爾士大學解剖學系進修一年半，研究外周補體參與神經病理痛的機制，掌握了各種炎性痛、神經病理痛模型的制備方法和研究思路，為進行針刺鎮痛原理研究奠定了堅實的基礎；2007年9月回國，在華中科技大學同濟醫學院神經生物學系任副教授；2009年11月至今在華中科技大學同濟醫學院神經生物學系任教授。主持或參與國家自然科學基金等省市級以上科研項目12 項， 指導研究生獲得湖北省優秀碩士學位論文獎3項。在國內外重要學術刊物上發表論文 30 余篇。獲得實用新型專利一項。

研究方向：疼痛的細胞與分子神經生物學，針刺對疼痛調整的機制研究

原文檢索：

Inhibition of GABAergic Neurons anExcitation of Glutamatergic Neurons in the Ventrolateral Periaqueductal Gray Participate in Electroacupuncture Analgesia Mediated by Cannabinoid Receptor .

doi: 10.3389/fnins.2019.00484

參考文獻：

1. Liu, L., Zhao, L. P., Zhang, C. S., Zeng, L., Wang, K., Zhao, J., et al. (2018). Acupuncture as prophylaxis for chronic migraine: a protocol for a singleblinded, double-dummy randomised controlled trial. BMJ Open 8:e020653. doi: 10.1136/bmjopen-2017-020653
2. Mist, S. D., and Jones, K. D. (2018). Randomized controlled trial of acupuncture for women with fibromyalgia: group acupuncture with traditional chinese medicine diagnosis-based point selection. Pain Med. 19, 1862–1871. doi: 10.1093/pm/pnx322
3. Musil, F., Pokladnikova, J., Pavelek, Z., Wang, B., Guan, X., and Valis, M. (2018). Acupuncture in migraine prophylaxis in Czech patients: an openlabel randomized controlled trial. Neuropsychiatr. Dis. Treat. 14, 1221–1228. doi: 10.2147/NDT.S155119
4. Fusumada, K., Yokoyama, T., Miki, T., Wang, Z. Y., Yang, W., Lee, N. S., et al. (2007). c-Fos expression in the periaqueductal gray is induced by electroacupuncture in the rat, with possible reference to GABAergic neurons. Okajimas Folia Anat. Jpn. 84, 1–9. doi: 10.2535/ofaj.84.1
5. Ho, Y. C., Lee, H. J., Tung, L. W., Liao, Y. Y., Fu, S. Y., Teng, S. F., et al. (2011). Activation of orexin 1 receptors in the periaqueductal gray of male rats leads to antinociception via retrograde endocannabinoid (2-Arachidonoylglycerol)-induced disinhibition. J. Neurosci. 31, 14600–14610. doi: 10.1523/JNEUROSCI. 2671-11.2011
6. Meng, I. D., Manning, B. H., Martin, W. J., and Fields, H. L. (1998). An analgesia circuit activated by cannabinoids. Nature 395, 381–383. doi: 10.1038/26481
7. Chen, L., Zhang, J., Li, F., Qiu, Y., Wang, L., Li, Y. H., et al. (2009). Endogenous anandamide and cannabinoid receptor-2 contribute to electroacupuncture analgesia in rats. J. Pain 10, 732–739. doi: 10.1016/j.jpain.2008.12.012
8. Palazzo, E., Luongo, L., Novellis, V., Rossi, F., and Maione, S. (2010). The role of cannabinoid receptors in the descending modulation of pain. Pharmaceuticals 3, 2661–2673. doi: 10.3390/ph3082661
9. Bobeck, E. N., Chen, Q., Morgan, M. M., and Ingram, S. L. (2014). Contribution of adenylyl cyclase modulation of pre- and postsynaptic GABA neurotransmission to morphine antinociception and tolerance. Neuropsychopharmacology 39, 2142–2152. doi: 10.1038/npp.2014.62
10. Takasu, K., Ogawa, K., Nakamura, A., Kanbara, T., Ono, H., Tomii, T., et al. (2015). Enhanced GABAergic synaptic transmission at VLPAG neurons and potent modulation by oxycodone in a bone cancer pain model. Br. J. Pharmacol. 172, 2148–2164. doi: 10.1111/bph.13039
11. Drew, G. M., Mitchell, V. A., and Vaughan, C. W. (2008). Glutamate spillover modulates GABAergic synaptic transmission in the rat midbrain periaqueductal grey via metabotropic glutamate receptors and endocannabinoid signaling. J. Neurosci. 28, 808–815. doi: 10.1523/JNEUROSCI.4876-07.2008
12. Tjen-A-Looi, S. C., Li, P., and Longhurst, J. C. (2009). Processing cardiovascular information in the vlPAG during electroacupuncture in rats: roles of endocannabinoids and GABA. J. App. Physiol. 106, 1793–1799. doi: 10.1152/japplphysiol.00142.2009
13. Yuan, X. C., Zhu, B., Jing, X. H., Xiong, L. Z., Wu, C. H., Gao, F., et al. (2018). Electroacupuncture potentiates cannabinoid receptor-mediated descending inhibitory control in a mouse model of knee osteoarthritis. Front. Mol. Neurosci. 11:112. doi: 10.3389/fnmol.2018.00112 
14. Bennett, G. J., and Xie, Y. K. (1988). A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain 33, 87–107. doi: 10.1016/0304-3959(88)90209-6 

本文由李熳教授撰稿，賽業生物授權編輯。