直接western blot檢測方法
 
在直接檢測方法中，酶直接連接到一抗上(圖1.5)。操作簡單，檢測步驟少。雖然直接檢測是快速和直接的，但它往往比間接檢測的靈敏度低，因為在這個過程中可以發生信號放大的步驟更少。此外，酶直接標記到一抗上可能會造成成本和資源上的限制。
 
間接western blot檢測方法
間接檢測方法比直接檢測方法更受歡迎，主要是靈敏度更高。通過間接檢測，識別感興趣的抗原的抗體，稱為一抗，(圖1.5)。檢測是通過添加標記的二抗實現的，二抗可以識別一抗上的特定表位。這種表位通常是種屬特異性的；例如，在兔體內產生的幾種不同的一抗都可以被同一種抗兔二抗體所識別。 當多個二抗與單一一抗結合，這使得檢測靈敏度提高，還增加了檢測的靈活性，因為用于檢測二抗的標簽的類型可以輕松更改。
 
抗體質量和種類
影響Western blot結果的主要因素之一是抗體的質量，尤其是一抗的質量。高質量的抗體-具有高特異性、高結合親和力和低背景-增加了檢測的特異性和敏感性，單克隆和多克隆一抗均可用。
一抗
多克隆抗體-多克隆抗體是利用機體對感興趣的抗原的免疫反應獲得的。它們直接從免疫動物的血清中分離出來，通常是兔子、山羊、驢或綿羊，因此是動物產生的所有抗體的復雜混合物。在免疫應答過程中，單個B細胞產生抗體，這種抗體可以識別抗原上的特定表位，不同的B細胞產生的抗體可以識別不同的表位。由于多克隆抗體識別抗原上的不同位點，多個抗體可以同時與抗原結合，使得多克隆抗體比單克隆抗體更敏感。然而，這種廣泛的結合特異性有時會導致多克隆抗體具有更高的背景信號。
 
單克隆抗體-單克隆抗體是從雜交瘤細胞系的上清液中收集而來的，雜交瘤細胞系是將單個抗體合成細胞與骨髓瘤細胞融合而成的細胞系。這些細胞系通常來源于小鼠或大鼠。由于使用的是單一的抗體產生細胞或克隆，雜交瘤細胞系產生的抗體相同，都能識別抗原上相同的表位。單克隆抗體比多克隆抗體信號弱，因為單克隆抗體只與單個蛋白結合
 
二抗
有多種類型的二抗可用于Western blotting檢測，使用的二抗類型取決于一抗的種類和類別、檢測方法等考慮因素
一抗的種類——單克隆一抗的種類和類型通常來源于小鼠或大鼠細胞，而多克隆抗體可從多種動物中分離得到。二抗必須對一抗物種具有識別特異性。因此，抗小鼠或大鼠的二抗必須與單克隆抗體同時使用，而從兔體內分離出一抗時，則應使用抗兔二抗。根據組成抗體的重鏈分子和輕鏈分子的類型，抗體可以分為不同的類和亞型(也稱為同型)。二抗必須與一抗類別或亞型相匹配，以便進行適當的識別。可以購買能夠識別所有類別(即所有小鼠IgG抗體)或特定類別(如小鼠IgG2a)的二抗。具有特定亞型的二抗對于同時檢測多個蛋白也很有用，因為每個二抗可以有不同的標簽。
特異性二抗
Anti H+L—抗重鏈和輕鏈抗體(H+L)對目標蛋白的重鏈和輕鏈部分都具有特異性。當一抗的種類未知時，通常使用這種類型的二抗。
輕鏈特異性-當免疫沉淀后進行Western blotting，通常使用只識別抗體輕鏈部分的抗體。使用該抗體可防止識別沉淀抗體的重鏈
 
抗體純化
一抗和二抗均可純化減少背景信號
親和純化——親和純化使用親和柱來去除不與所需表位結合的抗體。親和純化抗體具有更高的特異性，因為存在較少的目標外結合抗體。
預吸附-預吸附抗體也可以用來提高結合的特異性和減少交叉反應。例如，兔抗IgG抗體可能被預先吸附在小鼠、大鼠和山羊的IgG上，以防止識別其他種類的IgG。預吸附抗體具有很高的特異性，推薦用于多重Western blotting。
 
抗體標記
 
在選擇一抗(直接檢測)或二抗(間接檢測)抗體時，一個重要的考慮因素是與抗體結合的標簽類型。酶標記(用于化學發光或膠片檢測)、熒光標記或其他用于放大信號的小分子(生物素)。
 
酶標記-最常用的兩種酶是堿性磷酸酶(AP)和辣根過氧化物酶(HRP)。許多抗體都可以使用酶標記，這使得此類抗體非常受歡迎。由于是酶促反應，必須控制曝光來采集信號。化學發光具有過飽和限制，限制了檢測的動態范圍。 熒光標記——檢測抗體也可以直接用熒光基團標記，使用熒光檢測系統進行檢測。在適當波長的光激發下，熒光基團發出稍長波長的光。然后發射的光被成像儀捕獲并轉換成數字信號。與依賴酶的檢測方法不同，熒光基團發出的光是一致的，并且與膜上的蛋白量成正比，從而達到精準定量。