血管平滑肌細胞（VSMC）在健康狀態下處于去分化表型，在其受損時，循環系統中的血小板快速激活，通過凝血反應為受傷部位止血，同時對創傷部位釋放PDGF、血栓烷等生物活性介質，使VSMC切換為高分化表型，同時細胞處于促增殖狀態。血管內膜增生型糖尿病就是由于VSMC分化和去分化狀態切換機制失調引起的。然而，這類疾病的分子機制還不清楚。

云序生物攜手廣州市婦女兒童醫療中心科研團隊首次揭示血小板中miR-223通過調控靶基因表達從而介導創傷修復過程，同時建立了糖尿病分子機制模型，為日后細胞損傷修復過程提供了參考依據。

發表期刊：Journal of Clinical Investigation
影響因子：13.3
實驗方法：AGO2 RIP實驗，miRNA測序
實驗材料：VSMC與血小板共培養組（實驗組），VSMC未處理組（空白組）；模型小鼠等

1.活化血小板促進人類VSMC分化增殖
首先，本篇文章作者以人類VSMC與活化血小板共培養的細胞為實驗組（AP），未做處理的細胞為空白對照組（RP），進行qPCR和WB檢測，結果顯示共培養組細胞內與分化相關的marker顯著表達，同時細胞增殖能力減弱，這與常理相反。接著，作者從體外和體內角度分別借助共聚焦顯微鏡觀測到VSMC能夠分泌血小板。那么問題來了，血小板是否會攜帶其他分子動態的參與到分化過程呢？

   

圖1. 分化相關蛋白WB結果；共聚焦顯微鏡觀測VSMC能夠自主分泌血小板

2.血小板攜帶miRNA進入VSMC并參與分化過程
帶著前面的問題，作者通過查閱文獻，了解到前人曾經報道過血小板中富含大量的miRNA。那是否是由于血小板中的miRNA參與了細胞的分化呢？接下來的實驗就變的簡單了，借助高通量miRNA測序手段（云序生物miRNA測序服務）對比共培養細胞和未處理組細胞中差異表達的miRNA。測序結果檢測到3個與研究顯著相關的miRNA：分別為miR-223和miR-143/145。借助miRNA定量PCR驗證，發現三者都在共培養細胞中高表達，其中miR-223在共培養8h時高表達，miR-143/145在共培養24h時高表達。那知道了這三者在時間軸上的表達模式，它們發揮了什么樣的機制呢？于是，作者借助AGO2 RIP實驗（云序生物提供此項服務）在實驗組中拉取與AGO2蛋白直接結合的miRNA，通過miRNA 定量PCR，證實以上三個miRNA能夠直接與AGO2蛋白結合，參與了海綿機制，并且也證實血小板分泌的miRNA的確是起活性的。

          

圖2. miRNA高通量測序聚類圖；
miRNA定量PCR表明三者在共培養細胞中差異高表達

圖3. AGO2 RIP-miRNA 定量PCR證實以上三個miRNA參與了海綿機制

通過生信分析，預測與miRNA結合力最強的靶基因：KLF4，KLF5和PDGFRβ。當然，前面都是推測，作者通過熒光素酶實驗證實兩者是直接結合關系。接下來，作者主要研究了miR-223和PDGFRβ的關系。對靶基因PDGFRβ進行定量PCR后，發現其在受傷股動脈中高表達，證明創傷能使其表達量發生變化。并且，與miR-223表達量成反比。綜上，說明PDGFRβ的確是miR-223靶基因。

圖4. 生信分析預測miRNA和靶基因（3’UTR區）結合

   
圖5. 熒光定量證實miRNA和靶基因的表達量呈負相關
 

VSMC分化失常主要會使人患上血管增生型糖尿病，因此作者希望通過分子手段研究miR-223在糖尿病中發揮的機制。miRNA定量PCR結果顯示，miR-223不管在人還是小鼠的糖尿病組中都是低表達的模式。那miR-223在細胞中的定位是如何的呢？通過熒光原位雜交，作者發現糖尿病患者的血小板也被內化到VSMC中。因此推測，血小板內化至細胞后，引起血小板內部miR-223的低表達，從而促進了miRNA靶基因在體內的高表達，最終導致血管平滑肌細胞增殖和內膜增生的表型。

圖5. 熒光定量證實miRNA不管在人源還是鼠源都在糖尿病組中低表達；與靶基因的表達成反比；
miRNA低表達促進糖尿病患者血管內膜增生

5.構建VSMC損傷修復模型
作者首次提出VSMC損傷修復機制模型，機制的參與成員主要包括VSMC、內皮組織和血小板，如下圖所示。在未受傷個體中，內皮組織完整，VSMC和血小板間無相互作用。當受損時，內皮屏障受損，血小板活化，一方面釋放PDGF，TXA2等物質，另一方面攜帶miRNA進入VSMC中，提高靶基因的表達，從而促進細胞分化，抑制血管內膜增生。但當糖尿病患者受損傷時，血小板在釋放促修復物質方面與前者一致，但在分子機制上與普通損傷機制上截然相反。

圖6. 正常和糖尿病組中血小板通過運輸miRNA參與VSMC功能

總結：
本篇文章作者首先將血小板和VSMC共培養，發現細胞分化情況與常理相反的現象。由此推測血小板中的miRNA在起作用。推斷依據是：1. 觀測到血小板是由VSMC內化而來。2. 前人研究發現血小板中含有大量miRNA，為證實推測結果，作者通過miRNA高通量測序技術快速找出可能起作用的miR-223，并通過AGO2 RIP實驗證實miR-223參與了海綿機制。借助生信預測，驗證和熒光素酶實驗，找出了靶基因PDGFRβ。最后，推測出VSMC損傷修復的模型以及糖尿病模型中，作者發現了相反的機制，為今后臨床研究帶來了巨大的幫助。云序優勢總結
優勢總結：
值得一提的是，云序生物不僅僅為廣大科研用戶解決測序問題，更提供了機制解決手段。迄今為止，完成RIP和RNA pull down實驗達到100+案例，助力廣大科研工作者沖刺高分文章。