圖1. Edwin Southern^[7]

（埃德溫·邁勒·薩瑟恩）

Southern blot 實驗原理及步驟‍

了解了Southern 的由來，接下來小編帶大家一起學習Southern blot實驗原理及步驟。

Southern blot基本原理：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則特異性地雜交形成雙鏈。其操作過程是利用特定酶將DNA消化成片段，再進行電泳分離，然后將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的DIG標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA片段分子的含量（見圖2）^[2]。

blot 操作過程^[2]

 

Southern blot

檢測技術在模式動物制備中的應用‍
 

雖然距離這項技術發明已經過去很多年，但這項檢測技術仍被廣泛的應用在各種生物實驗研究中。

如下圖所示，為了鑒定攜帶條件性Satb1等位基因的供體質粒通過同源重組方式整合到小鼠的Satb1特異性位點上（見圖3a），研究者們提取供體小鼠與wild小鼠肝臟基因組DNA，經限制性內切酶Eco RV (b) or Spe I (c,d)酶切，同時選擇用于Southern印跡分析的DNA探針。探針位于待靶向的基因中，但在靶向載體外部設計5’與3’外源探針（5’ external probe與3’external probe）以及內源eGFP探針（GFP internal probe）。通過Southern blot檢測顯示，5’與3’外源探針分別與酶切后對應基因組片段發生雜交，說明供體質粒在5’與3’端與靶基因組同源重組（見圖3b，d），與預期插入位置一致；經內源eGFP探針雜交顯示為一條帶，說明條件性Satb1等位基因以單拷貝插入到靶基因座上（見圖3c）。^[3]

圖3. Southern blot分析鑒定供體質粒靶向小鼠Satb1 基因座及拷貝數^[3]

那么既然說是同源重組“事件”，對于“事件”肯定有很多不確定性。如圖4A所示，5’與3’同源臂均發生同源重組后，可將靶載體正確的插入到目的基因組中，獲得研究所需的目的片段。當然，有的時候也會出現異常情況（見圖4B），比如同源重組僅發生在5’末端，但3’末端沒有發生同源重組，而是直接被插入至基因組中。在這種情況下，5’外源探針顯示靶向等位基因片段符合預期，但3’端顯示為野生型片段。此時，如果不通過設計同源臂外兩側DNA探針策略來驗證同源重組是否正確，這很大程度上會增加后續研究的風險性。^[4]

圖4. Southern blot鑒定同源重組事件^[4]

另外，在制備基因敲進和條件性基因敲除模式小鼠過程中，Southern blot檢測是非常重要的一步。在我們以往的工作中，其中一例Cre定點敲進課題（如圖5），Southern blot檢測結果顯示：小鼠1號，有明顯的隨機插入現象。

圖5. Southern blot 檢測定點敲進

Southern blot檢測技術雖不是萬能的，但絕對是金標準！

也有人會說：既然是隨機插入，很可能插入在不同染色體，理論上就完全可以通過后續交配稀釋或去除，那再多交配一代是不是就可以稀釋甚至去除隨機插入呢？

讓我們看看事實是怎樣的：依據我們大量的數據統計分析發現，采用ES細胞方式制備，大約有20%的概率有隨機插入，由于ES細胞法制備中可以在細胞這一步就進行Southern鑒定，進入下一批小鼠制備的ES細胞可以確保為Southern陽性；而采用CRISPR/Cas9技術，隨機插入的概率約32%，不同的是用CRISPR/Cas9就直接得到了小鼠，只能在小鼠水平篩除隨機插入。而這32%中有14%的隨機插入是無法靠交配傳代去除的（見圖6）。是否“隨機插入”不是真的“隨機”的呢？是不是像轉基因一樣，更多的情況是打靶載體或插入序列，會容易在目的插入位點插入多個拷貝，造成同一染色體/同一位點的多拷貝“隨機”插入呢？^[8] 我們沒有詳細做過調研，但是接近一半可分離的隨機插入比例，預示了有這種可能。而此時，只能通過Southern blot對基因組DNA特定序列定位，進而排除隨機插入的風險。^[5-6]

   因此，Southern blot雖然有它自己的限制，如費用高，片段有技術極限等，但仍然是模式動物制備檢測隨機插入的金標準！

圖6. 隨機插入的概率分析^[5]

百奧賽圖自主開發的基于C57BL/6小鼠胚胎干細胞的基因編輯系統具有獨特的品系優勢，CRISPR/Cas9技術自主研發的EGE^Ⓡ系統將同源重組率提高近20倍，并且一直堅持PCR/DNA測序和Southern blot鑒定雙重質控。目前基因改造大小鼠及細胞系年制備能力>1500項，靈長類動物4種。歡迎小伙伴們前來咨詢及合作！
 

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

[2] Nelson, D.L, Cox, M.M.Lehningers Principles of Biochemistry, 5th edition. 2008

[3] Sommer D, et al.Efficient genome engineering by targeted homologous recombination in mouse embryos using transcription activator-like effector nucleases. Nat Commun.2014;5:3045.

[4] http://ko.cwru.edu/info/targvect design.html

[5] http://www.sohu.com/a/24558079 3_227596

[6] http://www.bbctg.com.cn/index/index/knowledge/id/52.html

[7] https://baike.baidu.com/item/southern blot

[8] Ng P, et al. The Molecular Basis of Multiple Vector Insertion by Gene Targeting in Mammalian Cells. Genetics.1999 Mar;151(3):1143-55.