實驗原理

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術首先在1967年由Shapir0建立，其原理：聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯劑N，N’一亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑過硫酸銨(APS)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交聯形成的具有網狀立體結構的凝膠，并以此為支持物進行電泳。

丙烯酰胺凝膠電泳可根據不同蛋白質分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產生的不同遷移率將蛋白質分離成若干條區帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質，蛋白質樣品電泳后，就應只分離出一條區帶。SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質分子結合成復合物，使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質 SDS復合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，只是分子量的函數。這種電泳方法稱為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS-PAGE)。由于SDS-PAGE可設法將電泳時蛋白質電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度，因此常用來鑒定蛋白質分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋白質樣品很純，只含有一種具三級結構的蛋白質或含有相同分子量亞基的具四級結構的蛋白質，那么 SDS-PAGE后，就只出現一條蛋白質區帶。SDS-PAGE可分為圓盤狀和垂直板狀、連續系統和不連續系統。本實驗采用垂直板狀不連續系統。所謂“不連續”是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、pH和凝膠孔徑等所組成。

實驗材料

(一)試劑

1、30%丙烯酰胺混合液(Acr:Bis 為 29:1) 稱取丙烯酰胺(Acr ) 29g 及甲叉丙烯酰胺(Bis ) 1.0g ,用 去離子水溶解并稀釋至 100ml ,貯棕色瓶中于 4℃保存,可用一個月。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液 取 1mol/L HCL溶液 48ml 、三羥甲基甲烷(Tris ) 36.6g ,加雙蒸餾水 至 80ml 使其溶解,調 pH 至 8.8,然后用雙蒸餾水稀釋至 100ml ,置棕色瓶中, 4℃貯存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液 取 1mol/L HCL溶液 48ml , Tris5.98g , 加雙蒸餾水至 80ml , 調 pH6.8, 用雙蒸餾水稀釋至 100ml ,置棕色瓶中, 4℃貯存。

4、Tris-甘氨酸電泳緩沖液 稱取 Tris 6g、 甘氨酸 28.8g , 加蒸餾水 850ml , 調 pH 至 8.3, 加蒸餾水到 1000ml , 4℃貯存。用時可做 10倍稀釋。

5、10% 過硫酸銨(AP )(6)四甲基乙二胺(TEMED )或 β-二甲基氨基丙腈(DMAPN )。

6、10%SDS(十二烷基磺酸鈉) 稱取 SDS 10g,加蒸餾水 100ml 使其溶解。

7、四甲基乙二胺(TEMED )

8、上樣緩沖液 取 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液 6.25ml ,蔗糖 10g , SDS 2.3g, 1g/L溴酚藍 10ml ,加 蒸餾水溶解,混合至 100ml。

9、考馬斯亮藍染色試劑 考馬斯亮藍 R250染色液:濃度為 2.5g/L,用甲醇∶醋酸∶蒸餾水 =5∶ 1∶ 5的溶 液配制(V/V)。

10、脫色液:取冰醋酸 7.5ml 、甲醇 5ml ,加蒸餾水至 100ml。

11、蛋白質分子量標志物 市售中分子量蛋白質分子量標志物。也可選擇 5種以上的已知分子量蛋白質自 行配制,注意其分子量分布要能滿足需要,各種蛋白質的濃度基本相等。

(二)儀器

圓盤電泳槽(或垂直板電泳槽)、穩壓穩流電泳儀 、脫色搖床。

SDS-PAGE蛋白質電泳步驟

將收集的各樣品加入等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm離心10min，取上清-20℃保存備用。

1）按照電泳裝置的使用說明，裝好潔凈干燥的玻璃板。

2）分離膠的制備

按下列成分配制10mL 12%分離膠：

各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其小心地注入準備好的玻璃板間隙中，并為積層膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層水封頂，以防止空氣中的氧對凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成后，倒掉覆蓋的水層，用水清洗凝膠頂部數次，用濾紙吸干凝膠頂端的水。

3）積層膠的制備

按下列成分配制2mL 5%的積層膠：

各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其灌注到分離膠上，灌滿后小心插入加樣梳，盡可能避免產生氣泡。

4）待積層膠凝固后，小心拔下梳子。

5）將凝膠固定于電泳裝置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入20μL各樣品。

6）樣品在積層膠中電泳時，使用80V電壓，待溴酚藍帶進入分離膠后，將電壓升至120V，繼續電泳直至溴酚藍帶到達分離膠的底部且開始泳出膠底面，關閉電源。

7）卸下凝膠，將其浸泡在至少5倍體積的考馬斯亮藍R-250染色液中，置水平搖床上室溫染色至少4h，之后取出染色的凝膠并回收染液，以備再用，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍脫色液中，在水平搖床上脫色4-8h，其間更換脫色液3-4次，直至凝膠脫色到條帶清晰為止，觀察記錄結果并拍照。

注意事項

1、做膠：防止漏膠、進氣泡以及花膠（水封、插梳子和拔梳子）。

2、加樣：兩邊加loading，加樣量一樣，加樣時間要盡量短，以免樣品擴散。

3、電泳：將膠夾好放于電泳槽中，加電泳buffer（內外面不能聯通），將電壓調到90V開始電泳。

4、本法也適合于其他生物樣品中蛋白質的分析。上樣量不宜過大,否則會出現過載現象。尤其是考馬斯亮 藍 R250染色, 在蛋白質濃度過高時, 染料與蛋白質的氨基 (-NH) 形成的靜電鍵不穩定, 其結合不符合 Beer 定律,使蛋白質量不準確。

5、Acr 和 Bis 有神經毒性,可經皮膚、呼吸道等吸收,故操作時要注意保護。

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