簡介
鑒于其在生物醫學研究的應用潛力，納米技術是一個快速發展的領域并受到科學界的持續關注。納米材料通常直徑小于100 nm，足夠能穿透哺乳動物細胞。同時，納米材料合成時不受形狀和元素組成限制。形狀上納米材料可以以桿狀，筒狀或顆粒狀呈現。不同的元素，如金屬，金屬氧化物或者它們的組合都能用于合成納米材料。納米材料具有較大的表面積體積比，因此適于通過表面功能化偶聯靶向或治療性分子。在全身給藥的情況下，偶聯的靶向分子可完成對特定細胞群體如腫瘤細胞的標記，而偶聯的治療性化合物則可以針對標記的細胞群體發揮作用。納米粒子的組成材料會有一個特定的帶隙，就是其電子基態和激發態之間的間距。一般情況下，電子處于基態，也就是能量最低的狀態。在吸收光子或光能量后， 電子躍遷至激發態，這兩個狀態之間的間距被稱為帶隙。一般單一或多特定波長的光會被納米顆粒材料選擇性吸收，其能量一部分會轉換成振動能，剩余的以熒光的形式發射，同時電子返回到基態。因此通過掃描、比較不同激發、發射波長下的熒光強度，我們可以獲得測試納米顆粒的特征光譜。目前對納米顆粒和其與分子相互作用的相關描述和檢測手段還十分有限。在此我們提出特征光譜分析作為一種新方法用于確定納米顆粒和表面涂層分子之間的相互作用。在表面結合到另外一個分子后，納米顆粒材料的電子特性會發生變化，引起其激發光和發射光的熒光峰發生遷移，也就是特征光譜的變化。因此，對比有無涂層的納米顆粒的特征光譜可協助我們確定納米顆粒和涂層分子之間是否發生了靜電相互作用。通過使用SpectraMax® i3x多功能微孔板讀板機并結合SoftMax® Pro自帶的光譜優化向導，我們在此展示了如何分析納米顆粒的特征光譜。光譜優化向導允許用戶自定義的激發和發射波長范圍組合的自動掃描。掃描結果以熱圖的形式展現。熱點則代表獲得最高信號時對應的激發發射波長對。通過比較熱點的位置可以發現不同樣本間是否出現光譜特征變化。

材料
• 氧化鐵納米顆粒
(PlasmaChem cat. #PL-FeO)
• 氧化鋅納米顆粒, <100 nm size
(Sigma Aldrich cat. #544906-10G)
• 聚乙二醇甲醚(mPEG5000, Sigma
Aldrich cat. #81323-250G)
• 超純水
• 96孔黑板(Greiner cat. #655076)
• SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機

方法
納米顆粒的制備

用分析天平稱取氧化鐵納米顆粒(Fe2O3NP) 2 mg于微量離心管中，以1 mL超純水重懸制成2 mg/mL儲液，震蕩混懸后備用。移出100 μL儲液于新微量離心管中，加入100 μL超純水，得到1 mg/mL的納米顆粒對照樣品，震蕩混懸后移至96孔板黑板中的選定孔中。用分析天平稱取氧化鋅納米顆粒ZnONP)3.5 mg于微量離心管中，以1 mL超純水重懸制成3.7 mg/mL儲液，震蕩混懸后備用。移出57 μL液于新微量離心管中加入143μL超純水，得到1 mg/mL的納米顆粒對照樣品，震蕩混懸后移至96孔板黑板中的選定孔中。

納米顆粒表面功能化
在兩個新微量離心管中分別加入100 μL氧化鐵納米顆粒儲液和57 μL氧化鋅儲液。用分析天平秤取4 mg mPEG溶于1 mL超純水，獲得終濃度為4 mg/mL的儲液，震蕩混懸后向每個溶有納米顆粒的離心管中加入50 μL mPEG 儲液，然后用超純水補足至200 μL，震蕩混懸后移至96孔黑板中，靜置30分鐘以確保完成包被。

熒光檢測
按照表1的參數用SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機檢測樣本的熒光值。在初步掃描中，氧化鐵納米顆粒對照和包被樣本以260 nm激發，以5 nm 步進在295nm至750 nm范圍掃描發射光譜。氧化鋅納米顆粒樣本則以350 nm 激發，5 nm 步進在375 nm至750 nm范圍掃描發射光譜(表1)。讀板前微孔板以回旋振蕩方式高速振蕩5秒鐘。完成初步驗證后，按照用戶定義的激發光和發射光范圍使用光譜優化向導(Spectral Optimization Wizard，SOW)進行一系列的熒光值讀取，并獲得每個樣本的最佳波長組合。SOW可按照表2的設定進行初始化。點擊Read后會彈出一個新的對話框讓用戶確定激發和發射波長的測試范圍。此次實驗中激發波長的掃描范圍為250到500 nm，發射波長范圍為300到700 nm。對于氧化鐵納米顆粒樣本，掃描步進為10 nm。對于氧化鋅納米顆粒樣本掃描步進則為5 nm。對所有的樣本讀取高度為默認1 mm。參數對話框參見圖2。

數據采集
光譜優化向導旨在識別樣本的最佳激發和發射波長組合并以此為基礎進行后續的檢測。軟件本身不會自動保存分析熱圖和相關熒光值數據。但是，我們可以在熱圖窗口打開的情況下，右擊熱圖，選擇復制原
始數據(Copy Raw Data)，并粘貼到合適的軟件中，做到原始數據的導出。如果原始數據是導出到電子表格，因為軟件沒有自動輸出原始數據能力，必須手動輸入掃描中使用的激發和發射波長參數。掃描中
的原始熱圖可以通過在Softmax Pro軟件中右鍵，選擇圖片另存為(Save Image As)的方式導出。

結果
在260nm波長激發，580nm波長發射組合下，氧化鐵納米顆粒具有最高的熒光值(10.1K相對信號強度，圖3，頂圖)。在mPEG包被下，氧化鐵納米顆粒的最高熒光值為5.1K，此時激發波長為270 nm，發射波長為570nm(圖3，底圖)。因此，相較于沒有包被的對照樣本，mPEG包被引起最佳激發和發射波長10 nm的遷移。由于光譜預掃描中采用的是10 nm步進，因此所觀察到的微弱遷移可能是來源于測量變異。但是近乎一半的熒光強度下降表明一些微弱的相互作用，即使到了結合解離平衡階段，也會引起顯著的熒光淬滅。相比下，氧化鋅納米顆粒在390 nm波長激發，670 nm波長發射下具有最強的熒光值13K，圖4，頂圖)。在mPEG包被下，氧化鋅納米顆粒最佳波長組合變為380 nm波長激發，695 nm波長發射，此時熒光值為95.6K(圖4，底圖)。因此，在5 nm 掃描步進下，mPEG包被能引起25 nm最佳發射波長的遷移，說明mPEG多聚物和氧化鋅納米顆粒表面存在相互作用。因為mPEG的結合會改變表面原子的電子性質。同時熒光信號的增強表明存在多聚物和材料中氧分子的相互作用。表3總結了上述的光譜掃描結果。

總結
測試中觀察到的20 nm 激發和發射波長位移表明氧化鋅納米顆粒和mPEG多聚物之間出現了靜電相互作用，相比下mPEG處理則不能引起氧化鐵納米顆粒的光譜特征改變。在此，我們展示如何通過結SoftMaxPro軟件的光譜優化向導，用SpectraMaxi3x多功能微孔板讀板機進行納米顆粒的表征和其表面相互作用的分析。該方法不僅可以用于質控納米分析表面功能化過程，還可以進一步在利用納米顆粒為載體運送靶向治療化合物的藥物開發過程中確保產品的正確包裝。