今天的帖子的靈感來自于我和同事在教他們SDS-PAGE和western blot的實驗交談中。 他們對于qRT-PCR（R）和流式細胞術（R）精通，特別關心如何以及為什么使用某些上樣質控，還有其它的技術被使用驗證，蛋白質表達和抗體特異性的變化。

樣品準備和上樣質控

理想地，上樣質控是多步驟過程的一部分，以確保將標準量的蛋白加載到所分析的每個樣品的凝膠上。 分離樣品的第一步通常是進行蛋白測定，BCA和Bradford測定法是最流行的兩種，允許在開始測定之前標準化樣品濃度。 第一步的幾個技術問題，排除污染物質的干擾，準備或者分離樣本。 考慮到這個原因，應與蛋白質測定一起考慮其預分離標準化技術，例如使用恒定樣品量或細胞數。

一旦樣品開始分離和轉移，經常被忽視的對照是要進行膜染色，我在前一篇文章中討論過。 免染膠和麗春紅染色是檢驗轉移效率的一種很好的驗證技術，但是如果加載了相等量的樣品，樣品也應該看起來大致相似。 利用現代圖像采集和分析技術，還可以使用麗春紅（R），考馬斯藍（R）和免染方法（R）進行基于蛋白質（R）的總蛋白定量。 然而，由于在轉印后進行麗春紅染色，與PVDF和硝酸纖維素膜結合，并且也很容易洗掉，因此很難將其推薦到其他技術上。

所以，加載上樣質控。 大多數人都喜歡用beta-actin和GAPDH作為內參。 然而，應該考慮組織類型，感興趣的蛋白定位和大小，因為在文獻中有許多實例證明加載內參確實變化很大（R，R，R）。 這是一個很好的資源，詳細說明了一些加載內參以及其分子量和細胞定位，但是需要閱讀文獻來評估以前的研究。

然而，在樣品制備和分析western blot定量過程中執行所有三個質控步驟，蛋白定量應變得輕而易舉，特別是如果使用生物成像系統進行多重標記成像，允許上樣質控和感興趣的樣品同時顯現，總蛋白定量和校正。

Western blotting中的抗體質控

抗體對照，在Western blotting中，與FACS或免疫組織化學（IHC）等其他基于抗體的技術相比，這一領域通常被忽略。 部分原因是由于電泳期間蛋白質的分離，這使得確定抗體特異性更容易。 然而，總是值得考慮引入對照進行驗證的重要性，特別是對于印記膜的定量。

陽性和陰性

陽性對照是Western印跡中最廣泛使用的，有幾種類型可用。 全長重組蛋白質作為理想的陽性對照，因為它們應該與天然蛋白分離是相同的，如果產生標準曲線，也可以用作進一步定量的標準品。 然而，重組蛋白不能使用的，因為成本可能是令人望而卻步的。 在這些情況下，可以使用陽性細胞或組織樣品，包括已被修飾以過度表達感興趣的蛋白的樣品。

在另一個方向上，陰性對照樣品也可能被用上，使用完整的空白，更好的對照是缺乏目的蛋白的裂解物。 如果感興趣的蛋白質是相對組織特異性的，或者可以通過敲除產生。