簡介

用熒光方法定量細胞增殖可以簡單快速的檢測藥物或其他實驗處理方法對細胞生長的影響。Life Technologies公司的CyQUANT細胞增殖試劑盒是一個敏感性高、可重復并且簡便的做熒光微孔板檢測的方法。CyQUANT的GR染料可標記到細胞核上，通過熒光來計算細胞個數。DNA與RNA的比例會隨著細胞周期的變化而改變，因此，CyQUANT試劑盒可以通過RNA酶溶解產物和核酸量做標準曲線。

本應用介紹了如何應用CyQUANT試劑盒和Molecular Devices公司的SpectraMax微孔板檢測系統及SoftMax® Pro軟件檢測細胞增殖。文中共介紹了兩種方法，一種是基于細胞的方法，另一種是將細胞樣品用RNA酶溶解后做DNA標準曲線。

優勢

- Rapid and convenient quantitation of cell growth
- Sensitive detection of as few as 50 cells
- Easy data analysis with preconfigured SoftMax Pro Software protocol

材料

- CyQUANT 細胞增殖試劑盒 (Life Technologies cat. # C7026)：Component A，400X CyQUANT GR 染料； component B，20X細胞溶解液； component ，100 μL濃度為 100 μg/mL的λ DNA 標準樣品溶液
注意： 細胞溶解液和染料稀釋后需在幾小時內使用，CyQUANT GR染料溶液需避光保存。
- 細胞系： CHO-K1 細胞(ATCC # CCL-61)
- EDTA溶液(Fisher Chemicals cat. # S311-100)
- NaCl 溶液(Fisher Chemicals cat. # S271-500)
- 無DNA酶的RNA酶A或RNA酶混合液(Ambion cat. # 2286)
- 黑色底透96孔板(Corning cat. # 3603)
- 具有熒光檢測模塊的SpectraMax微孔板讀板機 (Molecular Devices)

細胞準備

CyQUANT實驗的貼壁或不貼壁細胞可以直接在微孔板中培養細胞然后冷凍，或者在培養皿中培養細胞，然后冷凍細胞樣品轉移動微孔板中。詳細步驟可參考CyQUANT細胞增殖試劑盒產品說明書MP-7026。

基于細胞的CyQUANT實驗法

準備細胞

步驟1：用胰酶或EDTA溶液將貼壁細胞消化下來，用培養基將細胞懸液按表中濃度稀釋后放入96孔板，對照組為不含細胞的培養基。
步驟2：將孔板置于37℃環境下直到檢測增殖的時間。孵育時間取決于細胞類型、增殖檢測類型及實驗目的。
步驟3：吸出孔中的細胞培養液，用PBS清洗一次，若細胞貼壁不牢可不洗。
步驟4：將孔板置于-70℃冷凍細胞直到檢測(至少一小時，長可達數周)。冷凍步驟有利于細胞樣品的完全裂解。

制備細胞樣品做標準曲線

注意：最好使用與實驗中使用的標準曲線相同類型的細胞類型。

步驟1：用胰酶或EDTA溶液將貼壁細胞消化下來，用培養基將細胞懸液稀釋至105-106cells/mL。
步驟2：取1mL細胞懸液200g(約1,500rpm)離心5分鐘，棄掉上清，將管底離出細胞置于-70℃冷凍直到檢測。冷凍步驟有利于細胞樣品的完全裂解。

準備試劑

步驟1：制備1X細胞裂解液，用蒸餾水以1:20稀釋細胞裂解液儲存液，需制備每孔200μL。
步驟2：制備1X CyQUANT GR染液/細胞裂解液，用1X細胞裂解液以1:400稀釋CyQUANT GR染液儲存液。稀釋液需置于塑料器皿中，而非玻璃器皿中。

制備基于細胞法的標準曲線和樣品

步驟1：將之前冷凍的離出細胞放在室溫幾分鐘解凍。加入1mLCyQUANTGR染液/細胞裂解液，渦旋使細胞重懸。假設細胞為106個，細胞裂解液相當于106cells/mL。
步驟2：在孔板中以1:2的稀釋梯度放入細胞懸液，最高為50,000cells/mL，最低為24cells/mL。加入CyQUANTGR染液/細胞裂解液使每孔液體終體積為200μl。每個濃度四個重復，并在空余孔中設幾個對照組(無細胞)。
步驟3：將微孔板避光放置于室溫2-5分鐘。

設置儀器和軟件參數

步驟1：打開微孔板讀板儀開關，打開SoftMaxPro軟件并點擊ProtocolLibrary中CellGrowth&Viability文件夾中的CyQUANTFluorescenceprotocol。
步驟2：按表中所示參數設置儀器，此設置已在預配置的列表中。
步驟3：使用TemplateEditor設置孔板加樣的模板，包括標準樣品孔(每孔的細胞數)、空白對照孔(無細胞)和樣品孔的位置。模板設置的列子如圖1所示。注意，同時點擊Ctrl和Shift鍵將顯示每個孔的設置值，樣品的名字(Un01-Un02)沒有出現在所示圖中。
步驟4：將微孔板放于讀板機中，如果您的讀板機頂讀法需要放置適配器(如SpectraMaxM5)，請先放置適配器后再放入樣品。
步驟5：點擊軟件的Read鍵，儀器將對微孔板進行讀值，相關的熒光值(RFUs)將出現在軟件的孔板位置。

數據分析

步驟1：如果設置了模板，微孔板讀值后，在Grouptable里將會自動出現計算后的結果。
步驟2：TemplateEditor里設置了標準曲線組的話，標準曲線將會有軟件自動生成。在CurveFit下拉菜單里可以選擇擬合曲線公式，本應用說明的標準曲線選擇的是log-log曲線擬合(圖2)。也可以用quadratic曲線。
步驟3：計算實驗樣品每孔的細胞個數。軟件通過標準曲線公式計算出每個實驗樣品的濃度，并顯示在Unknownsgroup部分。

基于細胞的標準曲線結果

基于細胞的標準曲線如前文所述，呈現在圖2中。在生成標準曲線時采用了log-log擬合算法，圖中所示結果是SpectraMaxM5微孔板讀板機得到的，MolecularDevices公司的其他具有熒光功能的讀板機均可得到相似結果(數據未顯示)。

表3為表1中所列出的CHO-K1細胞樣品培養兩天的增殖數據結果，培養第二天的細胞增殖結果由SoftMaxPro軟件用基于細胞的標準曲線計算得出。

RNA酶處理、基于DNA含量做標準曲線的CyQUANT實驗法

細胞增殖同樣可以用DNA含量來評價并作出標準曲線。根據細胞曲線可計算出DNA含量，細胞裂解液經過RNA酶處理就排除了RNA對結果的干擾。在本應用說明中，列出了用DNA含量做標準曲線來定量細胞樣品的設置步驟。

準備試劑

步驟1：制備1X細胞裂解液，用蒸餾水以1:20稀釋細胞裂解液儲存液，需制備每孔200μL。一部分細胞裂解液加入1mMEDTA和180mMNaCl，一部分不加EDTA和NaCl。
步驟2：制備1X和2XCyQUANTGR染液/細胞裂解液，用1X細胞裂解液以1:400或1:200稀釋CyQUANTGR染液儲存液。稀釋液需置于塑料器皿中，而非玻璃器皿中。

在塑料管中制備DNA標準樣品

步驟1：用1X細胞裂解液稀釋試劑盒中100μg/mLDNA標準樣品，稀釋成1μg/mL存儲液。
步驟2：將DNA存儲液按表4所列按梯度稀釋。
注意：CyQUANT試劑盒中的是λ噬菌體DNA，本文中的數據都是按標準梯度稀釋。對于自己的實驗也可選擇其他來源的DNA樣品，具體操作請參考產品說明書MP-7026。

準備細胞

依據所用的細胞系(貼壁還是不貼壁)，按照Life Technologies的CyQUANT說明書選擇適當的細胞培養(微孔板中還是培養皿中)和凍存方法，在-70℃凍存細胞。本文中，貼壁細胞要先從培養皿中消化下來，然后離心，并將離心得到的細胞斑塊凍存。

準備細胞樣品、標準曲線DNA樣品和空白

步驟1：將之前冷凍的離出細胞放在室溫幾分鐘解凍。加入1mLCyQUANTGR染液/細胞裂解液，渦旋使細胞重懸。
步驟2：預處理細胞，每孔中加入含1mMEDTA和180mMNaCl的細胞裂解液，并在4個沒有細胞的孔中加入同樣的細胞裂解液(空白對照孔)。如果樣品為之前冷凍的細胞離心斑塊，先用100μL裂解液重懸，然后轉移到微孔板中。在有細胞的樣品孔和空白對照孔中分別加入4μLRNA酶(每孔兩個單位，詳見下文)。室溫孵育1小時。
注意：無DNA酶的RNA酶處理細胞時濃度不超過10μL中含有飽和活性單位。例如，試劑盒中混合RNA酶濃度為500U/mL，所以每4μL中含有兩個活性單位。
步驟3：在有細胞的樣品孔和空白對照孔中分別加入100μL2XCyQUANTGR染液/細胞裂解液。
步驟4：將之前準備的DNA梯度稀釋液依次加入到微孔板中，孔板中因包含兩種對照，一種是加入稀釋液但無DNA的空白對照，另一種是只含有1XCyQUANTGR染液/細胞裂解液的孔板空白對照(無DNA和RNA酶)。
步驟5：室溫孵育2-5分鐘

設置儀器和軟件參數

步驟1：打開微孔板讀板儀開關，打開SoftMaxPro軟件并點擊ProtocolLibrary中CellGrowth&Viability文件夾中的CyQUANTFluorescenceprotocol。
步驟2：按表2中所示參數設置儀器，此設置已在預配置的列表中。
步驟3：使用TemplateEditor設置孔板加樣的模板，包括標準樣品孔、孔板空白對照孔和樣品孔(RNA酶處理的細胞)的位置。

讀板和數據分析

步驟1：將微孔板放于讀板機中。
步驟2：點擊軟件的Read鍵。
步驟3：儀器將對微孔板進行讀值后，相關的熒光值(RFUs)將出現在軟件的孔板位置，數據將依據設置分析出結果，并顯示在Grouptables中。
步驟4：TemplateEditor里設置了標準曲線組的話，DNA標準曲線將會有軟件自動生成。
步驟5：在CurveFit下拉菜單里可以選擇擬合曲線公式，本應用說明的標準曲線選擇的是log-log曲線擬合。
步驟6：軟件通過標準曲線公式計算出每個DNA樣品的濃度，并顯示在Unknownsgroup部分。

DNA標準曲線結果

基于細胞的標準曲線如前文所述，呈現在圖3中。在生成標準曲線時采用了log-log擬合算法，圖中所示結果是SpectraMaxM5微孔板讀板機得到的，MolecularDevices公司的其他具有熒光功能的讀板機均可得到相似結果(數據未顯示)。用RNA酶處理細胞檢測DNA含量做標準曲線的例子現實在表5中。在此應用說明中，一個系列的細胞濃度被計算。事實上，每孔細胞個數在50-50,000個之間(標準曲線范圍內)均可用此方法計算得到細胞DNA濃度。

圖4顯示橫坐標為每孔細胞個數，縱坐標為平均DNA含量，曲線范圍為50-50,000個細胞，結果如試劑盒說明書所述。圖5中顯示了RNA酶處理的和未處理的細胞樣品RFUs值的比較，說明RNA酶處理會降低細胞裂解液的熒光強度。

總結

CyQUANT細胞增殖實驗是快速的、靈敏的檢測細胞個數和細胞DNA含量的熒光方法。SpectraMax M5微孔板讀板機得到的數據結果與Molecular Devices公司的其他具有熒光功能的讀板機得到的結果相似。基于細胞的標準曲線和5分鐘的孵育，我們得到了與CyQUANT試劑盒相似的動態范圍(50-50,000個細胞)。應用λ DNA樣品得到的曲線及通過標準曲線計算DNA含量的下限位50個細胞。結合應用SoftMaxPro的軟件分析功能及預置的CyQUANT拍攝設置，提供了一個計算和得到數據便捷的方法。

參考文獻

1. Life Technologies Product InformationsheetMP 7026 1/12/01: CyQUANT CellProliferation Assay Kit (C-7026).